右美托咪定對神經病理性痛大鼠脊髓P2X3 和P2X4受體表達的影響*

陳桂玲，張加強

（1.河南省義馬市義煤總醫院，河南 義馬 472300；2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003）

右美托咪定對神經病理性痛大鼠脊髓P2X3 和P2X4受體表達的影響*

陳桂玲1，張加強2

（1.河南省義馬市義煤總醫院，河南 義馬 472300；2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003）

目的探討右美托咪定對神經病理性痛大鼠脊髓P2X3和P2X4受體表達的影響。方法 60只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、神經病理性痛組（NP組）和右美托咪定干預組（DI組），復制神經病理性痛大鼠模型。于模型復制即刻，DI組大鼠腹腔注射40μg/kg右美托咪定，間隔24 h給藥1次，連續進行至模型復制成功后14 d，Sham組和NP組給予等量生理鹽水腹腔注射。分別于復制模型前（T0）、復制模型后24 h （T1）、72 h（T2）、7 d（T3）和14 d（T4），對大鼠機械縮足閾值（MWT）和熱縮足潛伏期（TWL）進行測定。Western blot檢測大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達。結果 與Sham組比較，NP組和DI組大鼠T1、T2、T3、T4時MWT和TWL降低；與NP組比較，DI組大鼠T2、T3、T4時MWT和TWL升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Sham組比較，NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白升高；與NP組相比，DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 右美托咪定可有效改善神經病理性痛大鼠痛覺過敏癥狀，可能與抑制脊髓中P2X3和P2X4受體蛋白的表達有關。

右美托咪定；神經病理性痛；P2X3受體；P2X4受體

神經病理性痛作為臨床上常見的疼痛類型，發病機制較為復雜，患者常表現為自發痛、痛覺過敏等，尚無特效治療手段，且發病率較高，給患者身心帶來巨大痛苦[1]。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）作為機體能量供應物質，亦具有神經遞質功能。研究表明，ATP參與神經病理性痛發病過程[2]。P2X受體是配體門控陽離子通道受體，是ATP主要受體。研究表明，神經病理性痛大鼠背根神經節中P2X3和P2X4受體表達上調[3-4]。右美托咪定是臨床上常用的α2腎上腺素能受體激動劑，具有高度選擇性，是常用的鎮靜、鎮痛藥物[5]，但其具體的鎮痛機制尚未明確，本研究嘗試利用右美托咪定對神經病理性痛大鼠進行鎮痛，觀察其鎮痛效果，探討其可能的作用機制，以期為臨床實踐提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠60只，購自河南省實驗動物中心[合格證號：SCXK（豫）2011-0003]，體重180～220 g，飼養于標準條件下，自由攝食、進水。利用隨機數字表隨機分為假手術組（Sham組）、神經病理性痛組（NP組）和右美托咪定干預組（DI組），每組20只。所有大鼠實驗前在獨立環境中適應1周。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經病理性痛大鼠模型的復制 參照文獻[6]中的方法復制大鼠神經病理性痛模型。腹腔注射80 mg/kg巴比妥鈉麻醉后，對右后肢大腿進行備皮，消毒后，將皮膚沿右股骨下緣切開，對肌肉進行鈍性分離使坐骨神經充分暴露，于坐骨神經分叉前，用4號鉻制羊腸線連打4個松結，結與結間隔1 mm，讓神經外膜輕微受壓，力度以足指輕微抽動為準。將肌肉、筋膜及皮膚進行縫合后，將鼠重新放回籠子進行飼養，大鼠出現跛行、舔舐及懸空后肢等說明模型復制成功。Sham組大鼠將將坐骨神經暴露3～4 min，不進行打結。

1.2.2 干預措施 于神經病理性痛模型復制即刻，DI組大鼠腹腔注射40 μg/kg右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字：H20090251），間隔24h給藥1次，連續進行至建模后14 d，Sham組和NP組給予等量生理鹽水腹腔注射，實驗過程中各組大鼠未出現死亡。

1.2.3 機械縮足閾值 （mechanicalwithdrawal threshold，MWT）和熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）測定 分別于復制模型前（T0）、復制模型后24 h（T1）、72 h（T2）、7 d（T3）和14 d （T4），對大鼠MWT和TWL進行測定。將大鼠置于有機玻璃罩中，待其適應、安靜后，用美國Stoelting公司生產的Von Frey纖維絲，由小到大施加不同垂直壓力刺激大鼠左后腳掌第3、4趾間皮膚，直到出現抬足或舔足行為，重復測3次，每次間隔5 min，取均值作為MWT。大鼠在有機玻璃箱內適應20 min后，用北京凱輝盛達科技發展有限公司生產的熱痛刺激儀照射大鼠足底，記錄大鼠從開始照射到出現抬腿回避的時間，連續測3次，每次間隔5 min，取均值作為TWL。

1.2.4 Western blot檢測大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達 于復制模型后14 d測定MWT和TWL，將大鼠進行麻醉，處死后留取脊髓L4～6節段，10只大鼠的脊髓樣品用于總蛋白提取。樣品充分研磨后加入細胞裂解液（上海瑞齊生物科技有限公司）和蛋白酶抑制劑，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法對獲得的總蛋白定量。另外10只大鼠的脊髓樣品用于膜蛋白提取。脊髓樣品用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次后，用膜蛋白抽提試劑盒（上海勱瑞生物科技有限公司）提取細胞膜蛋白，用BCA法對獲得的細胞膜蛋白定量。分別取30μg總蛋白和膜蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至聚偏氟乙烯膜上，用3%胎牛血清封閉2 h，分別將兔抗大鼠P2X3受體、P2X4R多克隆抗體（美國Sigma公司，1∶500稀釋）加入，4℃過夜孵育，用三羥基甲胺-鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-HCl buffer saline，TBS）緩沖液沖洗3次，將辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000稀釋）加入，室溫下孵育60 min，用TBS緩沖液沖洗3次，用增強化學發光試劑盒（上海通善生物科技有限公司）發光顯像，用Quantity One圖像分析軟件進行分析，分別獲得脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素分析或重復測量設計的方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠的行為表現

3組大鼠在復制模型中和復制模型后均未出現死亡及術側后肢感染、自噬、運動功能喪失等。Sham組大鼠復制模型前后術側后肢運動未表現出現明顯異常，NP組和DI組大鼠復制模型后出現術側后抓內收、外翻及跛行，DI組大鼠在給予干預3 d后運動癥狀改善。

2.2 3組大鼠不同時間MWT和TWL的變化

2.2.1 3組大鼠MWT比較 Sham組、NP組和DI 組T1、T2、T3、T4的MWT比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①不同時間的MWT有差異（F=43.857，P=0.000）。②Sham組、NP組及DI組的MWT有差異（F=109.642，P=0.000），NP組、DI組較Sham組的MWT低，DI組較NP組的MWT高，右美托咪定可改善機械縮足閾值。③Sham組、NP組及DI組的MWT變化趨勢有差異（F=22.943，P=0.000）。見表1和圖1。

表1 3組大鼠不同時間MWT比較 （n=20，g，±s）

表1 3組大鼠不同時間MWT比較 （n=20，g，±s）

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圖13組大鼠MWT不同時間變化趨勢

2.2.2 3組大鼠TWL比較 Sham組、NP組和DI 組T1、T2、T3、T4的TWL比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①不同時間點的TWL有差異（F= 39.672，P=0.000）。②Sham組、NP組及DI組的TWL有差異（F=91.628，P=0.000），NP組、DI組較Sham組的TWL低，DI組較NP組的TWL高，右美托咪定可改善熱縮足潛伏期。③Sham組、NP組及DI組的TWL變化趨勢有差異（F=22.943，P=0.000）。見表2和圖2。

表2 3組大鼠不同時間TWL比較 （n=20，s，±s）

表2 3組大鼠不同時間TWL比較 （n=20，s，±s）

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圖23組大鼠TWL不同時間變化趨勢

2.3 3組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白表達

NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白與Sham組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白升高。DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白與NP組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白降低。見表3。

表3 3組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達 （n=20，±s）

表3 3組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達 （n=20，±s）

注：1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與NP組比較，P＜0.05

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3 討論

神經病理性痛作為臨床上常見的慢性頑固性疼痛，病情遷延反復，目前尚無有效的治療手段，給患者生活質量造成嚴重影響。坐骨神經擠壓傷模型作為經典的神經病理性痛動物模型，可模擬人類神經病理性痛表現，應用較為廣泛。本研究顯示，NP組和DI組大鼠模型復制成功后出現術側后抓內收、外翻及跛行；與復制模型時比較，NP組和DI組大鼠復制模型后MWT和TWL均降低，說明大鼠出現機械痛敏及熱痛敏，表現出神經病理性痛癥狀，提示成功復制神經病理性痛大鼠模型。

右美托咪定作為新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，可作用于神經元α2A受體而發揮鎮痛功能[7]。本研究顯示，DI組大鼠在給予干預3 d后運動癥狀改善，與NP組比較，DI組大鼠T1、T2、T3、T4時MWT和TWL升高，說明右美托咪定可有效改善神經病理性痛大鼠疼痛癥狀。ATP作為重要的能力供應物質，亦可與細胞表面受體結合而發揮信號傳導的功能，在疼痛產生過程中發揮重要調控作用[8]。P2X受體是ATP主要的受體類型，P2X3受體在與傷害性信息傳遞相關的中樞及外周神經細胞中分布廣泛，在疼痛信息傳遞及調控中發揮重要作用[9]。有研究指出，P2X3受體在坐骨神經結扎引起的神經性痛大鼠背根神經節中表達上調[10]。特異性抑制P2X3受體表達對大鼠的鎮痛功能[11]。P2X4受體作為ATP受體類型之一，主要在脊髓小膠質細胞中表達，參與神經病理性疼痛發生過程[12]。本研究顯示，與Sham組比較，NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白均升高，說明P2X3和P2X4受體均參與神經病理性痛發生過程。分析其原因，可能是在外周神經受損后，炎癥介質或損傷通過一系列級聯反應而使胞核中轉錄因子被激活，使P2X3和P2X4受體被大量轉錄及翻譯而參與痛覺過敏的發生[13]。而且在生物功能發揮中，只有位于細胞膜上的受體與配體結合才能發揮相應的生物學功能。本研究顯示，與Sham組比較，NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體膜蛋白均升高，說明在外周神經發生損傷后，大量的炎癥介質在促使胞核轉錄的同時，亦誘導溶酶體的胞吐功能，使產生的P2X3和P2X4受體被轉移到細胞膜，從而加速與ATP結合而參與痛覺過敏的產生[14]。本研究顯示，與NP組比較，DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白均降低，說明右美托咪定干預可降低脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白表達，從而患者疼痛的發生。分析其原因，右美托咪定可特異性與脊髓背角突觸前膜α2A受體結合，使突觸前抑制，減少鈣離子內流，從而減少ATP釋放，通過一系列級聯反應而使胞核中P2X3和P2X4受體表達減少，從而影響其在疼痛發生中的作用[15]。

綜上所述，右美托咪定可有效改善神經病理性痛大鼠痛覺過敏癥狀，可能與抑制脊髓細胞中P2X3 和P2X4受體蛋白的表達，并抑制其向胞膜轉運減少與配體結合有關。

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（童穎丹 編輯）

Effects of Dexmedetomidine on expressions of P2X3 and P2X4 receptors in spinal cord of rats with neuropathic pain*

Gui-ling Chen1,Jia-qiang Zhang2
(1.General Hospital of Yima Coal Industry Group,Yima,Henan 472300,China;2.People's Hospital of Henan Province,Zhengzhou,Henan 450003,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Dexmedetomidine on the expressions of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of rats with neuropathic pain.Methods Sixty healthy male SD rats were randomly divided into sham operation group (sham group),neuropathic pain group (NP group)and Dexmedetomidine intervention group (DI group).The neuropathic-pain rat models were constructed.At the start of model construction,the rats in the DI group were intraperitoneally injected with 40 μg/kg Dexmedetomidine, which was repeated at 24-h intervals till 14 d after the models were successfully constructed.The rats in the sham group and the NP group were given intraperitoneal injection of normal saline.Mechanical withdraw threshold (MWT)and thermal withdrawal latency (TWL)of the rats were detected before model construction (T0)and 24 h(T1),72 h(T2),7 d(T3)and 14 d(T4)after model construction.The expressions of total proteins and membrane proteins of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of the rats were detected using Western blot.Results Compared with the sham group,the MWT and TWL in the NP group and the DI group were decreased at T1-4;compared with the NP group,the MWT and TWL in the DI group were increased at T2-4,the differences were statistically significant (P＜0.05).Compared with the sham group,the expressions of total proteins and membrane proteins of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of the rats in the NP group were increased;compared with the NP group,the expressions of total proteins andmembrane proteins of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of the rats in the DI group were decreased,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusions Dexmedetomidine could effectively improve the symptoms of neuropathic hyperalgesia in the neuropathic-pain rats.It might be related with the inhibition of the expressions of P2X3 receptor and P2X4 receptor proteins in the spinal cord.

Dexmedetomidine;neuropathic pain;P2X3 receptor;P2X4 receptor

R741

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.006

1005-8982（2017）06-0027-05

2016-08-01

河南省2015科技發展計劃項目（No：152300410163）