MicroRNA-203抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的機制研究

郭清皓，蔡鈞，楊世疆，蔣林濤

（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院 急診創傷外科，湖北 武漢 430014）

MicroRNA-203抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的機制研究

郭清皓，蔡鈞，楊世疆，蔣林濤

（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院 急診創傷外科，湖北 武漢 430014）

目的探討microRNA-203（miR-203）對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響及機制。方法 通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定miR-203在正常成骨細胞hFOB及骨肉瘤細胞系中的表達，將MG-63細胞系分成miR-203組、Scramble組、RAB22A組、NC組，Lipofectamine 2000分別轉染miR-203 mimics、Scrambles、pcDNA3.1-RAB22A、空白對照質粒；通過噻唑藍（MTT）實驗測定增殖能力，細胞劃痕實驗測定遷移能力；通過Target Scan和雙熒光素酶實驗預測及驗證miR-203與RAB22A基因的靶向調節關系；RT-PCR測定RAB22A mRNA表達水平；Western blot測定E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平。結果 miR-203在骨肉瘤細胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63中較hFOB細胞系表達降低。MTT顯示，在培養48和72 h后，miR-203組相對細胞數少于Scramble組（P＜0.05）；培養24 h后，Scramble組細胞相對劃痕面積小于miR-203組（P＜0.05）；雙熒光素酶實驗示，miR-203與RAB22A基因存在靶向調節關系。RAB22A組相對劃痕面積小于NC組（P＜0.05）；MTT顯示，在培養24、48和72h后，RAB22A組相對細胞數多于NC組（P＜0.05）；RAB22A組與NC組比較，E-cadherin下調表達，N-cadherin上調表達，Vimentin上調表達。結論 miR-203通過下調RAB22A基因表達，抑制上皮間質轉化，進而抑制骨肉瘤細胞增殖與遷移。

miR-203；RAB22A；骨肉瘤；增殖；遷移

骨肉瘤多發于兒童或青少年，其常轉移部位是肺、胸膜[1-2]。進一步明確骨肉瘤的發病機制對提高診療水平具有重要意義。MicroRNA（miRNAs）是一類內源性的非編碼RNAs，其通過mRNA的3’非編碼區結合而靶向下調基因表達[3-4]。miRNAs調控著細胞周期、增值、凋亡等過程[5]。研究報道，miR-203參與乳腺癌、前列腺癌、食道鱗癌等多種腫瘤的增殖、遷移及侵襲過程[6-8]。然而，目前尚無miR-203對骨肉瘤增殖遷移影響的報道，本文研究microRNA-203 （miR-203）對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人成骨細胞系 hFOB、SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63骨肉瘤細胞系購自武漢大學醫學院實驗中心，無血清細胞凍存培養基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）、胎牛血清及胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，實驗所需的一抗購自美國Santa Cruz公司，二抗購自武漢博士德生物科技有限公司，miR-203 mimics和Scrambles由上海吉瑪基因化學技術有限公司定制合成，pcDNA3.1-RAB22A由美國Genscript公司定制，Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養、轉染及分組

所有細胞系采用RPMI 1640培養基（含10%胎牛血清和抗生素）培養于37℃、5%二氧化碳CO2、飽和濕度的恒溫細胞培養箱中。為探討miR-203過表達對MG-63細胞系增殖和遷移的影響。將對數生長期的MG-63細胞系分成兩組，分別為miR-203組和Scramble組，按Lipofectamine 2000說明書分別轉染miR-203 mimics和Scrambles，終轉染濃度為20nmol。培養24h后行噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]和細胞劃痕實驗。為探討RAB22A過表達對MG-63細胞系增殖和遷移的影響及其機制，將MG-63細胞系分成兩組，即RAB22A組和NC組。采用Lipofectamine 2000分別轉染 pcDNA3.1-RAB22A和空白對照質粒，培養24 h后行MTT及細胞劃痕實驗。

1.3 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應

按Trizol reagent說明書，從培養細胞中提取總RNA，然后按照TaqMan RNA reverse transcription kit（美國ABI公司）說明書，5 ng總RNA逆轉錄合成cDNA。在ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀中，以β-actin作為內參，量化miR-203的表達水平。使用SYBR Green PCR master mix試劑（美國Roche公司）在ABI 7500 qRT-PCR儀中進行qRT-PCR。miR-203正向引物：5'-GCTTTTGAGA ACGTGGATGAG-3'；反向引物：5'-CGAAGATGGTGG CATAGAGAA-3'；使用2-ΔΔCt方法定量，以U6小核RNA作為內參，計算miR-203的相對表達量。

1.4 生物信息學分析及預測

通過 TargetScan（http：//www.targetscan.org）、mir DB（http：//mirdb.org）及PicTar（http：//pictar.bio. nyu.edu）3種生物信息學軟件預測 miR-203與RAB22A的靶向關系

1.5 熒光素酶實驗

轉染前24 h將MG-63細胞接種于24孔板中，分成3組，即突變型質粒組、野生型質粒組及陰性對照組，突變型質粒組共轉染miR-203和突變型熒光素酶報告質粒pGL3-RAB22A 3’WT；野生型質粒組共轉染miR-203和野生型熒光素酶報告質粒pGL3-RAB22A 3’UTR，陰性對照組共轉染miR-203和對照熒光素酶質粒。24 h后使用雙熒光素酶報告基因系統進行熒光活性檢測。實驗重復3次，6個復孔/次。以海腎熒光素光吸收值作為內參，數據計算方法：螢光素酶活性=螢火蟲熒光素光吸收值/海腎熒光素光吸收值。

1.6 MTT實驗

MG-63細胞以1×104個/孔接種于12孔板中，培養24 h后行相應的轉染實驗，在培養箱中分別培養0、12、24、48和72 h后添加5 mg/ml MTT溶液40 μl，孵育4 h后加入二甲基亞砜200 μl/孔，搖床上充分震蕩。490 nm波長測定吸光度值。相對細胞數=實驗組數值/對照組數值×100%

1.7 細胞劃痕實驗

將miR-203組和Scramble組、RAB22A組和NC 組MG-63細胞用RPMI 1640（含10%胎牛血清）培養在6孔板上，待融合后，用滅菌槍頭劃直線，劃痕后0～24 h，用反轉的Olympus IX50顯微鏡通過10倍物鏡和Image-Pro Plus軟件捕獲測量劃痕面積，實驗重復3次，劃痕面積越大，表示遷移能力越弱。

1.8 Western blot檢測

培養24 h后消化細胞，提取細胞總蛋白，蛋白變性、上樣，每泳道上樣量為50μg蛋白。50V、100mA電泳2 h結束后，聚偏氟乙烯膜轉印。脫脂奶粉液封閉2 h。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水清洗，分別加入RAB22A一抗（1∶200）、E-cadherin一抗（1∶200）、N-cadherin一抗（1∶200）、Vimentin一抗（1∶200）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（1∶200），二抗濃度1∶1000，增強化學發光法顯影。用軟件Image J測量Western blot相關條帶進行定量。目的蛋白的相對數值=目的Western blot定量數值/GAPDH Western blot數值。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，用Graphpad 6.0統計作圖軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-203在骨肉瘤及正常成骨細胞系中的表達

qRT-PCR結果顯示，正常人類成骨細胞系hFOB 的miR-203相對表達量為（1.0±0.09），miR-203在骨肉瘤細胞系SAOS-2的相對表達量為（0.32±0.07）, miR-203在SOSP-9607細胞系的表達量為（0.30± 0.05），miR-203在U2OS細胞系的表達量為（0.26± 0.05），miR-203在 MG-63細胞系中表達量為（0.15±0.04），經方差分析，差異有統計學意義（F= 3.841，P=0.037）；進一步兩兩比較結果，骨肉瘤細胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63細胞系中miR-203相對表達量低于人正常成骨細胞系hFOB。見圖1。

圖1 miR-203在骨肉瘤和成骨細胞系中的表達

2.2 過表達miR-203抑制MG-63細胞的增殖和遷移

轉染miR-203 mimics后，miR-203組miR-203相對表達量為（9.3±0.3），Scramble組miR-203相對表達量為（1.5±0.2），經t檢驗，差異有統計學意義（t=37.469，P=0.021），miR-203組miR-203相對表達量高于Scramble組（見圖2A）。MTT結果示，在培養48 h后，miR-203組相對細胞數為（1.2±0.1），Scramble組相對細胞數為（2.5±0.2），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-10.069，P=0.019）；培養72h后，miR-203組相對細胞數為（2.1±0.2），Scramble組相對細胞數為（3.3±0.2），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-6.736，P=0.001），miR-203組相對細胞數少于Scramble組（見圖2B）。培養24 h后，Scramble組細胞相對劃痕面積為（25.4±4.3）%，miR-203組細胞相對劃痕面積為（81.5±6.3）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-12.739，P=0.031），Scramble組細胞相對劃痕面積少于miR-203組（見圖2C、D）。

圖2 過表達miR-203抑制MG-63細胞增殖和遷移

2.3 miR-203靶向抑制RAB22A基因的表達

通過TargetScan預測miR-203和RAB22A基因3'端非翻譯區的結合位點；構建野生型RAB22A 的3’UTR端、突變型的熒光素酶報告質粒及陰性對照熒光素酶質粒。野生型質粒組、突變型質粒組、陰性對照組的相對螢光素酶活性分別為（0.19±0.08）、（1.0±0.13）、（1.0±0.15），經方差分析，差異有統計學意義（F=4.753，P=0.025）；進一步兩兩比較，野生型質粒組與突變型質粒組、陰性對照組比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t=-8.252和-9.191，P=0.003和0.012），野生型質粒組熒光素酶活性低于突變型質粒組和陰性對照組（見圖3A）。

圖3miR-203靶向抑制RAB22A的表達

qRT-PCR結果顯示，miR-203組的RAB22A mRNA相對表達量為（0.22±0.09），Scramble組相對表達量為（1.00±0.14），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-8.117，P=0.025），miR-203組RAB22AmRNA相對表達量低于Scramble組（見圖3B），Western blot檢測顯示，miR-203組RAB22A蛋白表達量為（1.38± 0.41），Scramble組表達量為（4.28±0.49），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-7.861，P=0.012），miR-203組RAB22A蛋白表達量低于Scramble組（見圖3C）。

2.4 過表達RAB22A促進MG-63細胞增殖和遷移

MG-63細胞系轉染 pcDNA3.1-RAB22A后，RAB22A組RAB22A蛋白表達量為（8.20±0.48），陰性對照組為（1.1±0.18），經t檢驗，差異有統計學意義（t=23.988，P=0.039），RAB22A組RAB22A蛋白表達量高于陰性對照組（見圖4A、B）。培養24 h后，RAB22A組細胞相對劃痕面積為（18.4±2.3）%，陰性對照組為（41.5±5.9）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-6.318，P=0.001），RAB22A組細胞相對劃痕面積少于陰性對照組（見圖4C、D）。MTT結果顯示，在培養24、48和72 h后，RAB22A組相對細胞數分別為（2.3±0.16）、（2.8±0.23）和（3.5±0.31），陰性對照組相對細胞數分別為（1.6±0.13）、（2.3±0.19）和（2.9±0.23），兩組24、48和72 h相對細胞數比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.881、2.902和2.692，P=0.002、0.021和0.027），RAB22A組相對細胞數多于陰性對照組（見圖4E）。RAB22A組與NC比較，E-cadherin下調表達 [（0.18±0.09）vs（1.1± 0.15）（t=-9.109，P=0.000）]，N-cadherin上調表達[（4.6±0.73）vs（1.13±0.24）（t=7.821，P=0.000）]，Vimentin上調表達[（5.1±0.73）vs（1.09±0.19）（t= 9.207，P=0.000）]（見圖4F）。

圖4 過表達RAB22A促進MG-63細胞的增殖和遷移

3 討論

骨肉瘤是好發于長骨端的惡性腫瘤，診斷主要依靠病史、檢驗結果及影像學資料。局部腫痛、跛行為骨肉瘤的常見臨床表現，軟組織腫塊和骨皮質增生及特征性的Codmans三角為常見的影像學特征[9]。治療方法包括手術、化療、放療及免疫治療等。但骨肉瘤預后仍較差。據研究報道，年齡＜30歲的骨肉瘤患者5年生存率達60%，30～49歲的5年生存率達50%，＞50歲的5年生存率僅為30%[10]。近年來，一系列的醫學研究指出，miRNAs在不同腫瘤組織中表達異常，并對腫瘤的發生有著重要的作用[5-8]。因此miRNAs被認為是一種潛在的腫瘤診斷與治療的新靶標。近期報道指出，miR-203與乳腺癌、前列腺癌、食管鱗癌、膀胱癌,的增殖與遷移相關[6-8，11-13]。WANG等[6]報道，沉默miR-203可通過靶向BIRC5 和LASP1蛋白而抑制三陰乳腺癌增殖和遷移。miR-203被報道在前列腺癌組織中低表達，是抑癌基因，過表達miR-203可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[7]。在食管鱗癌中，miR-203可通過Np63信號通路抑制食管鱗癌細胞增殖[8]。梁佳等[12]報道，miR-203在食管癌細胞及組織中呈低表達，呈高甲基化狀態，且與TNM分期及組織分化程度相關。胡俊華等[13]報道，miR-203轉染胃癌細胞系SGC7901后，侵襲能力減弱，凋亡增加，并通過靶向調控SNAI 2降低胃癌細胞侵襲能力，促進其凋亡。徐磊等[14]報道，miR-203可靶向調節Bmi-1基因，下調其表達，通過下調Bmi-1基因表達抑制H1975肺腺癌細胞株的侵襲轉移，可作為一種潛在的抑制轉移的分子。

本研究探討miR-203對骨肉瘤細胞的增殖和遷移的影響及其調控機制，結果發現miR-203在骨肉瘤細胞系SAOS-2、SOSP-9607、U2OS及MG-63中呈顯著低表達，說明miR-203在骨肉瘤細胞系中表達異常。這與miR-203在前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中的表達情況相一致[6-8]。通過在MG-63細胞過表達miR-203，發現miR-203組的相對細胞數少于對照組，細胞劃痕面積大于對照組，提示miR-203抑制MG-63的細胞增殖及遷移能力，與前列腺癌、食管磷癌及乳腺癌中的報道相一致[6-8]。

RAB22A是Ras GTP酶超家族成員[15]。有研究表明，RAB22A是一個原癌基因，并與多種腫瘤關系密切[16]。例如，RAB22A促進胃癌的增殖及侵襲[17]。本課題探討miR-203對RAB22A基因的表達調控作用。實驗發現，miR-203抑制RAB22A 3’UTR介導的螢光素酶活性，并下調其基因和蛋白表達水平。因此，miR-203能直接抑制RAB22A基因的表達，RAB22A是miR-203的直接作用靶標。進一步實驗發現，RAB22A組MG-63細胞劃痕面積低于對照組，相對細胞數高于對照組。因此，RAB22A過表達能促進MG-63的細胞增殖及遷移，進一步發現，RAB22A下調E-cadherin，上調N-cadherin和Vimentin基因的表達。因此，RAB22A能抑制MG-63細胞的上皮間充質轉化。該結果與前述RAB22A在胃癌中的細胞調控功能相一致[17]。

綜上所述，miR-203通過抑制RAB22A基因的表達，進而抑制上皮間質轉化，而抑制骨肉瘤細胞的增殖及遷移。這是一種調控骨肉瘤細胞增殖與遷移的新機制，為骨肉瘤發病機制的研究提供新的線索。miR-203可望成為骨肉瘤診斷的一種潛在的生物標志物，并可能成為治療的新靶標。

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（童穎丹 編輯）

Mechanism of microRNA-203 inhibiting proliferation and migration of osteosarcoma cells

Qing-hao Guo,Jun Cai,Shi-jiang Yang,Lin-tao Jiang
(Department of Emergency and Trauma Surgery,the Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan,Hubei 430014,China)

ObjectiveTo investigate the potential role of miR-203 in the regulation of the proliferation and migration of osteosarcoma cells,as well as the regulatory mechanism.Methods The expression levels of miR-203 in the osteosarcoma cells and the normal osteoblasts were measured by RT-PCR.The MG-63 cell line was divided into miR-203 group transfected with miR-203 mimics,scramble group transfected with scrambles,RAB22A group transfected with pcDNA3.1-RAB22A plasmid and NC group transfected with blank plasmid by Lipofectamine 2000.The cell migration ability was measured by wound healing assay.Cell number was examined by MTT assay.The target relationship between miR-203 andRAB22Agene was predicted and verified by Target Scan software and double luciferase assay.The expression level ofRAB22AmRNA was measured by RT-PCR.The expression levels of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and RAB22A protein were measured by Western blot.Results Compared with the hFOB cells,the expression of miR-203 was significantly low in the osteosarcoma cell lines SAOS-2,SOSP-9607,U2OS and MG-63.MTT method showed that the number of MG-63 cells in the miR-203 group was significantly smaller than that in the scramble group aftercultured for 48 and 72 h (P＜0.05).After cultured for 24 h,the relative scratch area of the scramble group was significantly smaller than that of the miR-203 group(P＜0.05).TargetScan software and double luciferase assay verified the target relationship between miR-203 andRAB22Agene.The relative scratch area in the RAB22A group was significantly smaller than that in the NC group (P＜0.05).MTT method showed that the number of the MG-63 cells was significantly increased in the RAB22A group compared with the NC group after cultured for 24,48 and 72 h(P＜0.05).Compared with the NC group,E-cadherin expression was down-regulated,N-cadherin and Vimentin expressions were up-regulated in the RAB22A group.Conclusions MiR-203 inhibits proliferation and migration of osteosarcoma cells by inhibiting RAB22A gene expression and epithelialmesenchymal transition.

microRNA-203;RAB22A;osteosarcoma;proliferation;migration

R738.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.007

1005-8982（2017）06-0032-06

2016-09-27

蔣林濤，E-mail：lintaojiang99@21cn.com