激素替代-凍融胚胎移植周期子宮內膜的最佳容受時間研究

張昀，熊芳，徐洪燕，肖瀟，肖菊霞，周萍

（南京醫科大學附屬無錫市婦幼保健院，江蘇 無錫 214000）

激素替代-凍融胚胎移植周期子宮內膜的最佳容受時間研究

張昀，熊芳，徐洪燕，肖瀟，肖菊霞，周萍

（南京醫科大學附屬無錫市婦幼保健院，江蘇 無錫 214000）

目的探討激素替代-凍融胚胎移植（HRT-FET）周期子宮內膜的最佳容受時間。方法 根據子宮內膜暴露于黃體酮天數的不同（3、4、5、6和7 d），將52例行HRT-FET的患者依次定義為P3組、P4組、P5組、P6組及P7組，分別觀察各組胞飲突形態及覆蓋面積，并檢測整合素αvβ3、同源框基因A10（HOXA10）及LIF 3種蛋白的相對表達量。結果 多數患者在黃體酮補充6 d時，其子宮內膜胞飲突發育程度與αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白表達水平一致性達到最高。結論 將胞飲突發育程度檢測作為凍融胚胎移植時間評估的參考依據是可行，于黃體酮補充3 d時對胚胎進行移植，可能是實現子宮內膜與胚胎同步化的理想選擇。

激素替代-凍融胚胎移植；子宮內膜；容受

輔助生殖技術雖然提高激素替代-凍融胚胎移植（hormone replacement therapy-frozen embryo transfer，HRT-FET）的妊娠率，但是胚胎種植失敗仍時有發生[1]。受雌、孕激素影響，子宮內膜發生形態改變以利于胚胎黏附與著床，即種植窗。過早或過晚都將導致胚胎種植不接納。種植窗開放于黃體中期，各時間子宮內膜容受性取決于胞飲突完全發育成熟及整合素αvβ3（integrin alpha v beta 3，αvβ3）、同源框基因A10（homebox A10 gene，HOXA10）蛋白和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）[2-3]表達。關于黃體酮在HRT周期內補充多長時間最有利于胚胎移植，尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年7月-2015年9月在本院因輸卵管性不孕或男性因素不育而接受輔助生殖技術治療，并即將行HRT-FET周期的52例女性患者作為研究對象。年齡22～35歲，平均（27.6±3.7）歲。所有納入患者有規律月經周期、正常的基礎內分泌水平，并未使用任何宮內節育器；同時將合并有子宮畸形、排卵障礙、子宮內膜異位、盆腔粘連的患者，以及反復發生種植失敗的患者排除在外。所有受試者簽署知情同意書，經本院倫理委員會同意。

1.2 實驗方法

52例患者接受激素替代治療，自月經周期第3天開始連續7 d給予戊酸雌二醇，3 mg/次，2次/d，7 d后將服藥劑量調整至4 mg/次，連續服用6 d。在患者服藥過程中采用陰道超聲對其子宮內膜厚度（2個外強回聲線間的最大距離）進行實時監測，若經上述給藥后厚度＜8 mm，再按調整后的劑量繼續用藥3 d左右；當厚度≥8 mm后應用黃體酮（Progesterone，P）陰道緩釋凝膠，90 mg/d。根據子宮內膜暴露于P的天數（3、4、5、6和7 d）將52例患者全部入組，共5組，依次定義為P3組（9例）、P4組（11例）、P5組（12例）、P6組（11例）及P7組（9例）。各組患者的年齡、不孕年限及子宮內膜厚度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者在P完成給藥的次日采用pipelle內膜導管進行子宮內膜活檢標本的采集，取得樣本后立即采用生理鹽水進行清洗，隨后將各組樣本分作2份，其中一份采用2.5%戊二醛固定處理后于4℃條件下保存，制成電鏡標本后即采用掃描電子顯微鏡進行胞飲突形態及覆蓋面積的觀察。其中，胞飲突形態主要依據其發育狀態的分級情況進行判定，分為5級，分別為發育前、發育中、發育完全、衰退期及發育后。覆蓋面積即胞飲突占子宮內膜表面面積的百分比，每份樣本隨機選取10個區域，放大2 000倍進行觀察，完全未覆蓋（0%）計0分，少量覆蓋（≤20%）計1分，中等覆蓋（21～50%）計2分，大量覆蓋（＞50%）計3分，最后計算每份樣本的平均得分。另一份在清洗后立即用液態氮冷凍，并放置于-80℃冰箱冷凍儲存待檢，參考文獻[4]完成蛋白樣品制備，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為標準內參，采用Western blot檢測αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的相對表達量。見圖1。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均值±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 胞飲突發育狀態分級 （×2 000）

2 結果

2.1 5組子宮內膜標本的胞飲突形態分級

P3組與P4組基本全處于發育前或發育中狀態，隨著子宮內膜暴露于黃體酮時間的延長，處于衰退期和發育后的例數逐漸增加，P5組7例（58.3330%）發育中，4例（33.3330%）完全發育，1例（8.3333%）衰退期；P6組1例（9.0910%）發育中，8例（72.7270%）完全發育，2例（18.1820%）衰退期；P7組1例（11.1110%）完全發育，5例（55.5560%）衰退期，3例（33.3330%）發育后。見表1。

表1 5組子宮內膜標本的胞飲突形態分級 例（%）

2.2 5組子宮內膜標本的胞飲突覆蓋面積評分比較

電鏡顯示，P3組、P4組、P5組、P6組及P7組子宮內膜標本的胞飲突覆蓋面積評分分別為（0.88± 0.09）、（0.97±0.11）、（2.38±0.16）、（2.74±0.15）和（2.41±0.14），經方差分析，差異有統計學意義（F= 439.230，P=0.000），胞飲突在子宮內膜表面達大量覆蓋程度只存在于P5組、P6組及P7組中；P5組、P6組、P7組與P3組和P4組比較，差異有統計學意義（P=0.000），P6組與P5組、P7組比較，差異有統計學意義（P=0.000），P5組與P7組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 5組子宮內膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達水平比較

5組子宮內膜αvβ3、HOXA10、LIF 3種蛋白的表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F= 40.142、30.423和11.883，P=0.000）；P6組3種蛋白的相對表達量最高（P＜0.05）。見表2和圖2。

表25組子宮內膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達水平比較 （±s）

表25組子宮內膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達水平比較 （±s）

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圖2 5組子宮內膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達水平

3 討論

就當前體外受精-胚胎移植在臨床開展的情況來看，FET愈發變得常規化，但某些環節仍需進一步完善。在自然周期中，成熟的子宮內膜與胚胎發育存在良好地同步性，這是確保其在接觸時均能處于最理想狀態的生理性基礎。HRT-FET周期則往往不具備這樣的條件，目前關于在FET前最佳的黃體酮持續給予時同尚未達成共識。在HRT周期中，如果子宮內膜與胚胎未能較好同步，則可能發生種植窗口提前關閉、種植率降低或胚胎發育延遲等多種情況。如何更為滿意地實現同步化是當前生殖醫學領域的重點研究方向之一[5-6]。

有研究認為，呈完全發育狀態胞飲突的大面積出現與消失分別對應著種植窗開放與關閉的兩種狀態，并建議將胞飲突的該特征作為評估子宮內膜容受性及把握種植窗時間的形態學標志物[7]。但新近有個別學者對該觀點提出質疑，尤其在胞飲突持續時間方面爭議頗大。有研究者認為，胞飲突于月經周期的黃體中期所持續的時間＜48 h[8]；另有研究者則提出，胞飲突的一般出現于排卵后的一小段時間內，而持續時間則可能至黃體末期乃至妊娠11周左右[9]。基于多方研究存在較大的不一致性，故有學者得出通過胞飲突并不能對人類種植窗做出精確描述的結論。在本研究中，筆者發現偶爾也能在P3與P4組中觀察到呈完全發育狀態的胞飲突，雖然非常少量，但是由此推測，在黃體酮補充第8天內同樣也可能存在少量的呈完全發育狀態的胞飲突。其原因可能為子宮內膜胞飲突實為發育后的微絨毛細胞，且該發育過程受孕激素調節[10-12]。而在持續高水平孕激素的環境條件下，微絨毛細胞可能會表現有一個動態的變化周期，即微絨毛細胞→發育中胞飲突→完全發育胞飲突→衰退期胞飲突→微絨毛細胞。同時本研究中，P6組有8例（72.7%）處于完全發育狀態，且該組胞飲突覆蓋面積評分也最高。故推斷盡管胞飲突會以較少數量的形式零散存在于其他黃體期時間，但呈完全發育狀態胞飲突的數量可在某一時間達峰值，該時間可能為最佳容受性時間點。因此，或許除對胞飲突持續時間進行評估外，考察成熟胞飲突的數量也非常重要。

不同個體其成熟胞飲突數量達峰值的時間不完全相同。以28 d為常規周期，正常情況下的峰值出現時間為19～21 d（參照本研究為P5～P7），而大多數不孕女性則為第20天。在卵巢刺激周期，正常峰值時間為18～22 d，而大多數不孕女性則為第19天（第14天排卵），亦即是說較自然周期提前1～2d。在HRT周期中，不同女性峰值時間通常為周期第20～22天（參照本研究為P6～P8），黃體酮首次補充時間（即本研究的P1）為第15天。但未接受卵巢抑制治療患者其胞飲突出現的時間變化為P6～P10[13]。激素的應用及患者個體差異可能是導致峰值時間不同的重要原因[14]。在本研究中，多數患者在黃體酮補充第5天開始有觀察到胞飲突形成，在P6日達峰值，P7日開始衰退，而P5～P7對應自然周期的19～21d，該結果提示本研究方案中成熟胞飲突的形成時間與自然周期相似。

另一方面，本研究還發現一個非常有趣的現象，即是αvβ3、HOXA10及LIF 3種子宮內膜容受性分子標志物的蛋白表達水平同樣也在黃體酮補充6 d時達最高，這與胞飲突在HRT周期中的發育情況一致。該結果提示，αvβ3、HOXA10及LIF可能與胞飲突潛存著某種關聯，并通過一定的相互作用來共同影響子宮內膜容受性[15-16]。同時在本研究所開展的HRT方案中，黃體酮補充6 d子宮內膜具最佳容受性的時間點。然而相關研究發現，根據第3天體外凍融胚胎的發育情況及HRT周期方案，于黃體酮補充3 d時對第3天胚胎進行移植，胚泡植入正好發生在胞飲突呈完全發育狀態的時間[17]。故就本研究所實施的HRT方案而言，多數患者的最佳移植時間應該在黃體酮剛好補充3 d。根據本實驗結果，對種植反復失敗的患者，可以進行HRT周期模擬，于P5 或P6后采集內膜樣本，如樣本顯示絕大多數（＞50%）的胞飲突呈完全發育狀態，那么當天即為是最佳容受時間，即當天可移植。如樣本顯示胞飲突呈發展中狀態或衰退期狀態，則將最佳容受時間對應延遲或提前1 d，即延遲1 d移植或下一周期再行移植。

綜上所述，鑒于在本研究所開展的HRT方案中，多數患者于黃體酮補充6 d時，其子宮內膜胞飲突發育程度與αvβ3、HOXA10及LIF 3種子宮內膜容受性分子標志物的蛋白表達水平一致性達最高，故從操作便捷性角度出發，將胞飲突發育程度檢測作為FET時間評估的參考依據是可行的，同時在本研究HRT-FET周期中，于黃體酮補充3 d時對胚胎進行移植可能是實現同步化的理想選擇。

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（童穎丹 編輯）

Optimal time of endometrial receptivity in hormone replacement therapy-frozen embryo transfer cycles

Yun Zhang,Fang Xiong,Hong-yan Xu,Xiao Xiao,Ju-xia Xiao,Ping Zhou
(Wuxi Maternal and Child Health Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214000,China)

ObjectiveTo investigate the optimal time of endometrial receptivity in hormone replacement therapy-frozen embryo transfer(HRT-FET)cycles.Methods According to days of exposure to progesterone,52 cases undergoing HRT-FET were divided into P3 group,P4 group,P5 group,P6 group and P7 group. Pinopode morphology,coverage area,integrin alpha v beta 3 (αvβ3),homeobox gene A10 (HOXA10)and leukemia inhibitory factor(LIF)were detected and compared among the groups.Results Most of the cases had the highest expression of αvβ3,HOXA10 and LIF after 6-day exposure to progesterone.Conclusions It is feasible to evaluate the degree of sporadic development of embryos as embryo transfer time.The transplantation of the embryo on the 3rd day of progesterone supplementation may be an ideal choice for the synchronization of endometrium and embryo.

hormone replacement therapy-frozen embryo transfer;endometrium;endometrial receptivity

R<714.8 class="emphasis_bold">714.8 文獻標識碼：A714.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.011

1005-8982（2017）06-0054-05

2016-05-26