利拉魯肽對大鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝內質網應激的影響研究

朱紅霞，鄧曉龍，高靜，李曉嵐，王偉，王敏哲，陳軍輝

（1.新疆醫科大學第五附屬醫院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第六附屬醫院，新疆烏魯木齊 830002）

·實驗研究·

利拉魯肽對大鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝內質網應激的影響研究

朱紅霞1，鄧曉龍1，高靜1，李曉嵐1，王偉1，王敏哲1，陳軍輝2

（1.新疆醫科大學第五附屬醫院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第六附屬醫院，新疆烏魯木齊 830002）

目的探討利拉魯肽對2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝組織內質網應激（ERS）的影響。方法將健康雄性8周齡SD大鼠隨機分為正常對照組（NC組，n＝10）、單純高脂高糖喂養組（MC組，n＝9）、利拉魯肽低劑量治療組（GLP－L組，n＝10）和利拉魯肽大劑量治療組（GLP－H組，n＝8）。NC組喂常規飼料，MC組喂高脂高糖飼料，GLP－L組和GLP－H組自第9周起分別經皮下注射利拉魯肽0.4 mg／kg和0.8 mg／kg。檢測各組大鼠的血漿生化指標，并常規石蠟包埋切片，觀察大鼠肝臟脂肪變性；采用實時熒光定量PCR方法檢測肝臟組織固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）、內質網甘露糖苷酶樣蛋白1（EDEMI）和載脂蛋白B100（apoB100）mRNA表達。結果MC組大鼠血漿空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS）水平均較NC組、GLP－L組和GLP－H組顯著升高（P＜0.05），且MC組血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、游離脂肪酸（FFAs）和胰島素抵抗指數（HOMA－IR）水平均較NC組、GLP－L組和GLP－H組明顯升高（P＜0.05），而HDL－C水平則較上述3組顯著降低（P＜0.05）。GLP－H組血漿FBG及FINS水平較GLP－L組顯著降低（P＜0.05）；與NC組比較，MC組、GLP－L組和GLP－H組大鼠肝組織SREBP1，EDEMI mRNA表達均顯著升高（P＜0.05），apoB100 mRNA表達均下降（P＜0.05），GLP－L組和GLP－H組SREBP1，EDEMI mRNA表達明顯低于MC組大鼠（P＜0.05），apoB100 mRNA表達高于MC組，且GLP－H組SREBP1 mRNA表達均顯著低于GLP－L組（P＜0.05）。結論ERS參與了肝臟內游離脂肪酸誘導的細胞脂肪變性過程，利拉魯肽可能通過緩解T2DM模型大鼠肝臟組織內質網應激的激活，從而改善脂質代謝紊亂。

利拉魯肽；2型糖尿病；非酒精性脂肪肝；內質網應激

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在全球的發病率不斷升高，亞洲地區尤為顯著。研究顯示，中國患有糖尿病的成年人多達9 240萬，糖尿病前期患者1.428億，居世界首位[1]，合并非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者7 000萬左右。T2DM及NAFLD的發生與高血脂、胰島素抵抗、肥胖有關，胰島素抵抗、血脂異常、肥胖等相互作用引起體內脂質代謝紊亂，過多脂類沉積于肝臟，引起脂肪肝發生。內質網應激（ERS）是一種由于外界環境刺激而導致的錯誤折疊與未折疊蛋白質在內質網腔內聚集，以及Ca2＋平衡紊亂的狀態[2]。研究表明，ERS在T2DM及脂肪肝的形成過程中具有重要作用[3]。胰高糖素樣肽－1（GLP－1）是由胃腸道L細胞和胰島細胞分泌的一種內源性多肽[4]。利拉魯肽（liraglutide）是一種人源性的GLP－1受體激動劑，與GLP－1有97%的同源性，目前已應用于臨床糖尿病的治療。本研究中基于以上發病機制，通過高脂高糖飲食加注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）制備T2DM合并NAFLD動物模型，分別給予不同劑量的利拉魯肽腹腔注射，觀察肝臟組織結構變化，以明確ERS是否參與了游離脂肪酸(FFAs)誘導的細胞脂肪變性形成過程，并探討利拉魯肽對ERS的潛在影響，以及對早期防治糖尿病合并NAFLD的重要意義。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物建模與分組

健康雄性8周齡SD大鼠（上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，動物實驗許可證號為SY2012－0048），體質量為180～200 g；飼養條件為自由飲水、進食，室溫（20.0±2.5）℃。將大鼠適應性喂養后進行編號，隨機分為正常對照組（NC組，n＝10）和T2DM合并NAFLD模型組（n＝30）。NC組常規飼料，模型組高脂高糖飼料（基礎飼料82%，豬油10%，膽固醇2.5%，膽酸鈉0.5%，蔗糖5%）。第4周末，參照傳統方法建立T2DM模型[5]，隔夜空腹經腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，30 mg／kg）一次破壞部分胰島，NC組同法注射相應體積的生理鹽水。注射STZ 4周后，檢測血糖和胰島素，當連續2次以上出現空腹血糖(FBG)≥7.8 mmol／L，視為建立T2DM模型成功。

結果27只大鼠建模成功，簡稱T2DM大鼠。將T2DM大鼠隨機分為單純高脂高糖喂養組（MC組，n＝9），利拉魯肽低劑量組（GLP－L組，n＝10）和大劑量組（GLP－H組，n＝8）。自第9周起，GLP－L組和GLP－H組分別經皮下注射利拉魯肽注射液(丹麥諾和諾德公司，國藥準字J20160037，規格為每支3 mL∶18 mg)。取1 mL利拉魯肽用注射用水稀釋10倍后，再取上述溶液用注射用水稀釋10倍后，得0.06 g／L利拉魯肽。分別予利拉魯肽0.4 mg／kg和0.8 mg／kg，1次／日，共注射8周；MC組給予腹腔注射等體積生理鹽水。本實驗經院內動物實驗倫理委員會批準同意。

1.2 觀察指標檢測

血漿生化指標：空腹血糖（FBG）采用葡萄糖氧化酶法（One Touch血糖儀及血糖試紙購自強生醫療器材有限公司）；空腹胰島素（FINS）檢測采用放射免疫法，三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、FFAs檢測采用酶法，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書進行相關操作并計算。胰島素抵抗指數（HOMA－IR）＝FBG×空腹胰島素／22.5。

肝臟脂肪變性：取大鼠肝臟最大葉距邊緣5 mm處肝組織，40 g／L甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片。油紅O染色后，顯微鏡下（Leica公司IX71圖像系統）觀察肝細胞中脂質形成情況，評估脂肪變性程度。評估標準，按照肝小葉內含脂滴細胞數／總細胞數比值，0為（－），＜1／3為（＋），1／3～2／3為（＋＋），＞2／3為（＋＋＋）；分別將肝細胞脂肪變性分為無、輕度、中度、重度。

肝臟組織ERS相關基因mRNA表達測定：取肝組織100 g勻漿并提取總RNA后，以紫外分光光度計（Bio－Rad公司）測定其濃度，取1 μg總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用DNAstar 6.0版軟件，根據GenBank大鼠脂代謝相關靶基因載脂蛋白B100（apoB100）、固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）和內質網甘露糖苷酶樣蛋白1（EDEMI）mRNA序列，設計PCR引物，見表1。選擇最適條件分別對靶基因和內參基因B－肌動蛋白（β－actin）進行PCR擴增，PCR產物進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描分析系統拍照，并分析電泳條帶灰度值，以靶基因與β－actin電泳條帶密度比值計算各靶基因mRNA相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 血漿糖代謝和生化學指標

結果見表2。MC組大鼠血漿FBG和FINS水平均較NC組、GLP－L組和GLP－H組顯著升高（P＜0.05）；MC組血漿TC，TG，LDL－C，FFAs和HOMA－IR水平均較NC組、GLP－L組和GLP－H組明顯升高（P＜0.05），而HDL－C水平則較上述3組顯著降低（P＜0.05）。GLP－H組血漿FBG和FINS水平較GLP－L組顯著降低（P＜0.05）。

表2 大鼠血漿糖代謝和生化學指標比較（±s）

表2 大鼠血漿糖代謝和生化學指標比較（±s）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與MC組比較，bP＜0.05；與GLP－L組比較，cP＜0.05。下表同。

項目FBG(mmol／L) FINS( mol／L) TC(mmol／L) TG(mmol／L) HDL－C(mmol／L) LDL－C(mmol／L) FFAs(mmol／L) HOMA－IR NC組(n＝10) 5.48±0.38 406.14±27.84 1.26±0.35 0.45±0.13 4.72±0.69 1.11±0.25 1.62±0.32 1.85±0.41 MC組(n＝9) 9.25±0.86a491.95±35.47a1.91±0.25a0.72±0.19a3.51±0.49a1.92±0.41a2.58±0.47a3.83±0.82aGLP－L組(n＝10) 6.84±0.72ab451.09±29.62ab1.52±0.32b0.53±0.16b4.02±0.31a1.30±0.37b1.94±0.36b2.34±0.71bGLP－H組(n＝8) 5.92±0.64bc418.40±31.96bc1.30±0.24b0.48±0.15b4.52±0.73b1.26±0.41b1.70±0.32b1.96±0.61bF值／P值57.975／0.000 13.916／0.000 9.101／0.000 5.352／0.004 8.186／0.000 8.985／0.000 12.490／0.000 17.695／0.000

2.2 肝臟組織病理學變化

大鼠肝組織內存在的脂滴能被油紅O染料染成紅色，染紅脂滴的數量多少及分布面積存在差異。NC組大鼠肝組織細胞排列整齊，偶見染紅的脂肪細胞。MC組大鼠可見明顯染紅區域，肝組織內脂滴含量多，彌漫、大小不等，大量大泡樣脂滴分布在腺泡集中區域，部分脂滴出現融合現象。GLP－L組和GLP－H組可見染紅區域面積及程度均較MC組減少，顏色變淺，多以小脂滴存在，且GLP－H組較少，程度更顯著，肝細胞排列較整齊（見圖1）。

圖1 各組小鼠脂肪變性程度

可見，MC組、GLP－L組和GLP－H組大鼠肝細胞脂肪變性程度均高于NC組（P＜0.05），GLP－L組和GLP－H組大鼠和MC組比較，肝細胞脂肪變性程度下降（P＜0.05），GLP－H組大鼠與GLP－L組比較，肝細胞脂肪變性程度也有所下降（P＜0.05）。詳見表3。

表3 4組大鼠肝臟細胞脂肪變性情況(只)

2.3 肝臟組織ERS 相關基因mRNA 表達特征

結果見表4。與NC組比較，MC組、GLP－L組和GLP－H組大鼠肝組織SREBP1，EDEMI mRNA表達均顯著升高（P＜0.05），apoB100 mRNA表達均下降（P＜0.05），GLP－L組和GLP－H組SREBP1，EDEMI mRNA表達明顯低于MC組大鼠（P＜0.05），apoB100 mRNA表達高于MC組，且GLP－H組SREBP1 mRNA表達均顯著高于GLP－L組（P＜0.05）。

3 討論

內質網是一個膜性細胞器，是蛋白質合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所，也是細胞的Ca2＋貯存器。多種因素如缺血－再灌注、低氧、缺乏生長因子、鈣失衡、自由基、乙醇、藥物、病毒感染、氧化應激、代謝障礙、突變基因表達的結構異常，使蛋白在內質網堆積等導致內質網功能紊亂，都會引起未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網腔內集聚，從而誘發未折疊蛋白反應，產生ERS[6－7]。ERS已被證實參與多種疾病的分子機制，包括肥胖和T2DM，而后兩者均為NAFLD的高危因素。

表4 4組大鼠3組大鼠肝臟組織SREBP1，EDEMI mRNA，apoB100 mRNA表達值比較

SREBP1是肝內最重要的調控脂肪酸從頭合成的轉錄因子[8]。其作為一種ERS蛋白與肝脂質代謝紊亂有密切關系，可引起與TC／TG合成和攝取相關基因表達的增加，導致肝細胞內TC和脂肪酸的集聚。ERS在apoB100的合成和分泌過程中也具有重要的調節作用。apoB100是肝臟合成和分泌富含TG的極低密度脂蛋白(VLDL)所必需的載脂蛋白，VLDL形成于肝臟，能轉運輸出肝臟合成的TG，apoB100影響和制約著肝細胞合成和分泌VLDL，引起肝臟脂質積累[9－10]。EDEMI是屬于糖苷酶47家族且亞細胞定位于內質網的一種Ⅱ型跨膜蛋白[11]。當內質網功能發生紊亂導致錯誤折疊蛋白或無功能蛋白在腔內的大量蓄積時，啟動內質網相關糖蛋白降解（GERAD）途徑，促進ERS時產生的不完全折疊或錯誤折疊蛋白在內質網中降解[12－13]，從而維持了內質網內環境穩態平衡和正常生理功能的執行。毛劉峰等[14]的研究結果顯示，18周齡高脂飲食T2DM小鼠肝臟EDEMI mRNA表達增加，apoB100基因表達量降低，表明T2DM小鼠脂肪肝的形成過程中存在肝臟內質網相關性降解增強，并導致apoB100合成和分泌的減少，加速脂肪肝形成。

利拉魯肽為長效人GLP－1類似物，可刺激內源性胰島素釋放，同時降低食欲、減慢胃排空；能顯著降低FBG及餐后血糖、TG及游離脂肪酸水平[15－16]。由表2和表3可見，利拉魯肽對T2DM模型大鼠的血糖、血脂水平均有降低作用，且對大鼠的肝臟功能、肝細胞脂肪變性均有防護作用，并呈現一定的劑量反應關系。由表4可見，MC組、GLP－L組和GLP－H組大鼠肝組織SREBP1、EDEMI mRNA表達均較NC組顯著升高，apoB100 mRNA表達均較NC組下降，GLP－L組和GLP－H組SREBP1、EDEMI mRNA表達明顯低于MC組大鼠（P＜0.05），apoB100 mRNA表達高于MC組，且GLP－H組SREBP1 mRNA表達均顯著低于GLP－L組，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示高脂高糖誘導的T2DM模型可顯著激活大鼠脂肪組織內質網應激信號通路，利拉魯肽對T2DM模型大鼠肝臟組織ERS的激活有顯著的緩解作用。

綜上所述，ERS參與了肝臟內游離脂肪酸誘導的細胞脂肪變性的過程，利拉魯肽可能通過緩解T2DM模型大鼠肝臟組織內質網應激的激活，從而改善脂質代謝紊亂，延緩NAFLD發病的進程，對T2DM合并NAFLD的防治起到一定的作用。

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Effects of Liraglutide on Endoplasmic Reticulum Stress in Mice with T2DM and Fatty Livers

Zhu Hongxia1,Deng Xiaolong1,Gao Jing1,Li Xiaolan1,Wang Wei1,Wang Minzhe1,Chen Junhui2

(1.The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Wulumuqi,Xinjiang,China830011;2.The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Wulumuqi,Xinjiang,China830002)

Objective To investigate the effects of liraglutide on endoplasmic reticulum stress(ERS)in mouse with T2DM and fatty livers.MethodsSD mice of 8 weeks were subdivided into four groups:the first group was given regular diet(NC group,n＝10),the second group received high fat and sugar diet(MC group,n＝9),the third group was given high fat and sugar diet and low dose of liraglutide (GLP－L,n＝10)and the forth group was given high fat and sugar diet and high dose of liraglutide(GLP－L,n＝8).The rats in GLP－L group and GLP－H group were given 0.4 mg／kg and 0.8 mg／kg of liraglutide by subcutaneous injection from the 9th week.The mRNA expression of genes(SREBP1,EDEMI and apoB100)were measured by quantitative real－time PCR.ResultsFat metabolism(FBG)and fasting plasma insulin(FINS)in MC group were significantly higher than those in NC,GLP－L and GLP－H group,and Plasma total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high－density lipoprotein(HDL－C),free fatty acids(FFAs)and HOMA－IR in MC group were also significantly higher than those in MC,GLP－L and GLP－H group(P＜0.05).However,Low density lipoprotein (HDL－C)in MC group was lower than that in NC,GLP－L and GLP－H group(P＜0.05).FBG and FINS in GLP－H group were significantly lower than those in GLP－L(P＜0.05);compared with NC group,the expression of SREBP1,EDEMI and apoB100 mRNA were higher significantly up－regulated(P＜0.05),but the above indicators in GLP－L and GLP－H group were obviously lower than those in MC group(P＜0.05),additionally,the expression of SREBP1 in GLP－H group were significantly lower than that in GLP－L (P＜0.05).ConclusionERS plays a central role in development of liver steatosis,but liraglutide may reduce the activation of ERS in T2DM mouse then slow the process of NAFLD incidence.

liraglutide;type 2 diabetes mellitus;non－alcoholic fatty liver disease;endoplasmic reticulum stress

R965；R977.1＋5

A

1006－4931(2017)01－0006－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.01.002

2016－07－13；

2016－09－28)

新疆維吾爾自治區自然科學基金[015211C182]。

朱紅霞（1974－），女，碩士研究生，主治醫師，研究方向為內分泌與代謝疾病，（電子信箱）2780019047＠qq.com。

王敏哲，男，碩士研究生，主任醫師，研究方向為內分泌與代謝疾病，（電子信箱）wangminzhe2008＠186.com。