纖維素酶法提取蘇子葉中黃酮類化合物的研究

姜顯光　余光景　姜美玲

摘要 為探究纖維素酶法對提取蘇子葉中黃酮類化合物的效果，通過單因素試驗，得到最佳提取工藝條件：溫度為57 ℃，提取時間為1 h，酶的濃度為0.4 mg/mL，提取次數為3次。纖維素酶法的平均回收率為 90.40%，相對標準偏差為5.01%，測得蘇子葉中黃酮類化合物的含量為1.609 mg/mL。該法比傳統堿液提取蘇子葉中黃酮類化合物的提取率提高了3倍以上。

關鍵詞 蘇子葉；黃酮類化合物；纖維素酶法；提取

中圖分類號 S567.23 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0248-02

Abstract In order to investigate the effect of cellulase on extraction of flavonoids from perilla leaf，through single factor experiment，the optimum extraction conditions were obtained：temperature 57 ℃，extraction time 1 h，the concentration of enzyme 0.4 mg/mL，extracted 3 times.The average recovery of cellulase was 90.40%，the standard deviation was 5.01%，the content of flavonoids measured in perilla leaf was 1.609 mg/mL.This method is better than traditional alkali extraction of flavonoids from perilla leaf，its extraction rate increases by more than 3 times.

Key words perilla leaf；flavonoids；cellulase method；extraction

蘇子葉具有降氣消痰、平喘潤腸等功效，屬于第一批被中國衛生部確定的既是食品又具醫藥保健功能的物質，可以開發出多種保健食品，在醫藥、食品工業上具有廣泛的用途[1]。黃酮類化合物廣泛存在于高等植物體中，是植物長期自然選擇過程中產生的一些次級代謝產物，在花、葉、果實等組織中多為苷類，而在木質部組織中則多為游離的苷元[2]。許多研究表明黃酮類化合物具有顯著的抗氧化、清除氧自由基、擴張心血管作用，可降血脂、阻斷動脈粥樣硬化、調節免疫機能、抗炎抗病毒、利膽、強心、鎮靜鎮痛和抗腫瘤等[3]。因而，近年來關于黃酮類化合物的研究尤為活躍。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物材料。所用蘇子葉產于吉林省延邊市。

1.1.2 儀器。TU-1201紫外可見分光光度計（北京普析通用）、HH-4電熱恒穩水浴鍋（國華電器有限公司）、FA21D4N電子天平、SHB-B95型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）等。

1.1.3 試劑。蒸餾水、乙醇、蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所，含量92.5%），5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液、氫氧化鈣溶液、稀硫酸等（均為分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖維素酶法提取。將蘇子葉晾干，粉碎40～60目[4]，準確稱取5.000 0 g置于錐形瓶中，加入200 mL的蒸餾水，浸泡24 h，將pH值調至4.5～6.5[5]，加入纖維素酶放入恒溫水浴鍋加熱，一段時間后將其取出抽濾，濾液在60℃以下加熱[6]，待將要得到膏狀物質時，停止加熱，最后用400 mL 60%乙醇將其溶解，待測。

1.2.2 吸收波長的測定[7]。移取1 mL提取液分別置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液混合，再用60%乙醇定容，混勻靜置10 min。以0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液、0.3 mL 10%硝酸鋁溶液、2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，再加入60%乙醇定容，得到的溶液作為參比溶液，在400～800 nm掃描，得到其吸收光譜，最大吸收波長為510 nm。

1.2.3 工作曲線回歸方程的建立[7]。準確稱取蘆丁標準試劑10.8 mg于100 mL容量瓶中溶解，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，即得到標準品。準確移取上述標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中。依次加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液混勻，用60%乙醇稀釋至刻度線，10 min后于波長510 nm處測定其吸光度。得線性回歸方程為A=0.055 2c-0.002 3，R2=0.999 7[8]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對黃酮類化合物提取率的影響。纖維素酶的最適溫度范圍為45～65 ℃[9]。因此，分別選取溫度為45、49、53、57、61、65 ℃，提取時間為1 h，纖維素酶的濃度為0.8 mg/mL，提取1次按1.2.1的提取方法試驗。結果表明，當溫度為57 ℃時黃酮類化合物提取率最高（圖1）。

2.1.2 時間對黃酮類化合物提取率的影響。分別選取時間為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h，溫度為57 ℃，纖維素酶的濃度為0.8 mg/mL，提取1次。結果表明，當提取1 h時黃酮類化合物提取率最高（圖2）。

2.1.3 纖維素酶濃度對黃酮類化合物提取率的影響。分別選取纖維素酶濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，溫度為57 ℃，提取時間為1 h，提取1次。結果表明，纖維素酶濃度為0.4 mg/mL時黃酮類化合物提取率最高（圖3）。

2.1.4 提取次數對黃酮類化合物提取率的影響。設置溫度為57 ℃，提取時間為1 h，纖維素酶濃度為0.4 mg/mL，分別提取1、2、3、4、5次（提取次數≥2時，后一次提取液要與前面提取液混合）。從圖4可以看出，當提取3次后，曲線處于緩慢上升狀態，提取率稍有提高，但從藥品成本和工作量等因素綜合考慮，提取3次最佳。

2.2 精密度、加樣回收與穩定性試驗

2.2.1 精密度試驗。按1.2.1的提取方法提取3次，制備4個不同濃度的樣品，分別在510nm波長下測定吸光度9次，計算其濃度和平均值，求得標準偏差，結果見表1。

2.2.2 加樣回收試驗。稱取蘇子葉粉末3份，在樣品中加入蘆丁標準品5.0 mg，將樣品和標準品混合物按1.2.1的方法提取3次，結果見表2。

2.2.3 穩定性試驗。按照樣品測定方法，分別在0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 h測定同一樣品溶液的吸光度，試驗結果表明樣品測定液中的黃酮在2.0 h內穩定。

3 結論

本試驗以測得蘇子葉中黃酮類化合物含量為指標，采用纖維素酶法，以溫度、提取時間、纖維素酶濃度和提取次數為變量進行試驗，利用紫外分光光度法進行檢測，經過數據處理結果和圖像分析，得到最佳提取工藝條件：溫度為57 ℃、提取時間為1 h、纖維素酶濃度為0.4 mg/mL、提取次數為3次，測得蘇子葉中黃酮類化合物的含量為1.609 mg/g。

本試驗提取3次，做了精密度試驗和加樣回收試驗，精密度試驗的相對標準偏差<1.76%，加樣回收試驗的平均回收率為90.40%，相對標準偏差為5.01%。

纖維素酶法提取蘇子葉中黃酮類化合物的研究表明，酶反應時將植物組織分解，較大提高了黃酮類化合物的提取率，比傳統提取堿液提取效率要高很多，高小龍等[9]用堿液提取蘇子葉中黃酮類化合，提取率為0.482 mg/g，而用纖維素酶法提取，提取率為1.609 mg/g，比傳統堿液提取率高了3倍多，而且耗能少、污染少、操作相對簡便。但是，溫度、pH值、纖維素酶的濃度、提取時間和提取次數都會影響酶的活性，直接關系到黃酮類化合物的提取率，因而增強酶的活力是考察的重點方面。例如，可以對天然纖維素進行處理，以改變天然纖維素的結構，降低纖維素的結晶度，脫去木質素，以增加纖維素和纖維素酶的接觸面積，提高纖維素酶的效率[10]。隨著酶學的發展，纖維素酶在提取植物有效成分方面的應用必然有更為廣闊的發展前景。

4 參考文獻

[1] 云南植物研究所.中國植物志[M].北京：科學出版社，1997：54.

[2] 哈成勇.天然產物化學與應用[M].北京：化學工業出版社，2003：338.

[3] 梅鈞，湯自豪.藥用植物中黃酮類化合物免疫調節作用研究進[J].九江醫學，2009，24（4）：90-92.

[4] 唐浩國.黃酮類化合物研究[M].北京：科學出版社，2009：36

[5] 何國慶，丁立孝.食品酶學[M].北京：化學工業出版社，2006：112.

[6] 曹鍵，師俊玲.食品酶學[M].鄭州：鄭州大學出版社，2011：34

[7] 姜顯光，侯冬巖，回瑞華，等.馬蘭葉中總黃酮的提取[J].天然產物研究與開發，2011，23（5）：967-969.

[8] 曹鍵，師俊玲.食品酶學[M].鄭州：鄭州大學出版社，2011：170

[9] 高小龍，董遠清，劉冬雪，等.堿液法浸提蘇子葉中黃酮類化合物及含量測定[J].鞍山師范學院學報，2015（17）：93-95.

[10] 宋述芹，谷茂，陳飛鵬，等.固相微萃取氣質聯用分析羅勒花和葉的揮發性成分[J].質普學報，2008，29（2）：110-114.