菱角多糖提取及抗氧化能力研究

董向東，孟秀梅，王晶晶，李明華

（1.江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安 223003；2.江蘇食品加工工程技術研究開發中心，江蘇淮安 223003）

菱角多糖提取及抗氧化能力研究

董向東1，2，*孟秀梅1，2，王晶晶1，2，李明華1，2

（1.江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安 223003；2.江蘇食品加工工程技術研究開發中心，江蘇淮安 223003）

以提取菱角淀粉后的離心液為原料，采用蛋白酶酶解的方法制備菱角多糖，通過單因素試驗及正交試驗進行提取條件優化。試驗結果顯示，蛋白酶添加量0.018%，酶解溫度50℃，酶解時間2 h，酶解pH值5時，菱角多糖提取率12.65%，其中蛋白質殘留率為1.08%，菱角多糖質量濃度1.5 mg/mL的羥基自由基清除率為56.8%。

菱角；多糖；酶法；提取

菱角，又名水栗、菱實，屬被子植物門、雙子葉植物綱、桃金娘目、菱科（Trapaceae），是一年生草本水生植物菱的果實，在我國已經有2 000多年的栽培歷史[1]。李向紅等人[2]對南方菱角的成分分析中得出其含蛋白質9%，脂肪5 mg/kg，糖20%，鈣9 mg/kg，VA 0.1 mg/kg，VB12.3 mg/kg，VB20.5 mg/kg，VC 50 mg/kg，VPP 19 mg/kg，南方菱角具有較高的營養價值。

目前，對菱角的利用主要有2個方面，一是鮮食，二是加工。然而，目前我國的菱角加工產品大多為初級產品，其科技含量、產品檔次、加工增值率都相對較低，市場競爭力弱。菱角多糖分別由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖組成，其中以葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖為主[3-4]。以制備菱角淀粉離心的上清液為原料進行菱角多糖的制備，而菱角蛋白水溶性好，多為可溶性蛋白[5]。根據這一特性，采用蛋白酶酶解的方法對菱角淀粉離心液中的蛋白質進行酶解去除，制備純度更好的菱角多糖，不但可以提高菱角的附加值，還可以實現菱角的綜合利用。

1 材料與設備

1.1 材料

新鮮菱角，購自淮安城南菜市場；95%乙醇、醋酸、碳酸鈉、蛋白酶（100 000 IU/g），均為食品級、市售；硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、無水乙醇，均為分析純。

1.2 主要設備與儀器

DZF-6050型真空干燥箱，上海捷呈試驗儀器有限公司產品；JYL-C022型九陽料理機，九陽股份有限公司產品；RE-2000A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；循環水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產品；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司產品；BSA224S-CW型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；PHS-3CW型測定儀，上海理達儀器廠產品；DHP-9052型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 工藝流程

2.2 菱角多糖的制備

新鮮菱角去殼，獲得菱角肉，按照菱角肉與純凈水1∶1的比例置于九陽料理機中進行磨漿，至漿液細膩均勻后，將其置于高速離心機中；以轉速5 000 r/min離心20 min，離心后沉淀，經除雜后烘干制備菱角淀粉；將上清液采用蛋白酶進行酶解，將酶解液滅酶后置于旋轉蒸發儀中進行濃縮，濃縮至離心液體積的1/5左右即可；將濃縮液倒入燒杯中，緩慢地向濃縮液中加入4倍濃縮液體積量的80%乙醇，加入的過程中要一邊倒入乙醇，一邊用玻璃棒不斷地攪拌，加入乙醇的速度不能過快。待乙醇全部加入到濃縮液中，將其置于4℃冰箱中靜置24 h[1]；取出后，用高速離心機以轉速5 000 r/min離心10 min，收集沉淀；上清液回收乙醇重復利用，下層沉淀再加入95%乙醇清洗2～3次，然后置于真空干燥箱中進行干燥，即可得到菱角多糖。

2.3 單因素試驗

2.3.1 蛋白酶添加量對菱角多糖提取的影響

準確稱取一定量的菱角離心上清液，按照菱角肉量折算添加0.012%，0.015%，0.018%，0.021%，0.024%的蛋白酶；采用醋酸溶液調節酶解pH值至5，置于恒溫水浴鍋中50℃酶解1.5 h，酶解完畢后升溫至85℃，并保溫10 min進行滅酶；高速離心機進行離心，上清液進行真空濃縮，濃縮至原體積的1/5后加入4倍濃縮液體積量的80%乙醇；靜置沉淀經95%乙醇洗滌后進行真空干燥，即得菱角多糖。

2.3.2 酶解溫度對菱角多糖提取的影響

準確稱取一定量的菱角離心上清液，按照菱角肉量折算添加0.018%的蛋白酶；采用醋酸溶液調節酶解pH值至5，置于恒溫水浴鍋中30，40，50，60，70℃酶解1.5 h。后續步驟同蛋白酶添加量處理方式。

2.3.3 酶解時間對菱角多糖提取的影響

準確稱取一定量的菱角離心上清液，按照菱角肉量折算添加0.018%的蛋白酶；采用醋酸溶液調節酶解pH值至5，置于恒溫水浴鍋中50℃分別酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。后續步驟同蛋白酶添加量處理方式。

2.3.4 酶解pH值對菱角多糖提取的影響

準確稱取一定量的菱角離心上清液，按照菱角肉量折算添加0.018%的蛋白酶；采用醋酸溶液調節酶解pH值至4，5，6，采用碳酸鈉溶液調節酶解pH值至8，置于恒溫水浴鍋中在50℃下酶解1.5 h。后續步驟同蛋白酶添加量處理方式。

2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇蛋白酶添加量、酶解溫度、酶解時間及酶解pH值為考查因素，以菱角多糖提取率為指標，采用正交表L9（34）四因素三水平的試驗。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2.5 評定方法

2.5.1 菱角多糖提取率

2.5.2 蛋白質殘留率

菱角多糖中蛋白質采用凱氏定氮法進行測定[6]。

2.5.3 羥自由基的清除率

利用H2O2與Fe2+混合產生羥基自由基在體系內加入水楊酸捕捉羥基自由基并產生有色物質，該物質于波長510 nm處有最大吸收。反應體系中含9.8 mmol/L H2O22 mL，9 mmol/L FeSO42 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL。不同質量濃度的菱角多糖溶液2 mL，最后加H2O2啟動反應，于37℃條件下反應30 min，以超純水為參比，測量各質量濃度的吸光度A樣品。考慮到多糖本身的吸光度，以FeSO4，水楊酸-乙醇不同質量濃度的多糖溶液和純水作為多糖的本底吸收；對照組用蒸餾水代替水楊酸，測定吸光度A本底，空白組用蒸餾水代替多糖，測定吸光度A空白，按照下式計算羥基自由基清除率[7]。

3 結果與分析

3.1 蛋白酶添加量對菱角多糖提取的影響

蛋白酶添加量對菱角多糖提取的影響見圖1。

圖1 蛋白酶添加量對菱角多糖提取的影響

由圖1可知，隨著蛋白酶添加量的增加，菱角多糖提取率呈現不斷上升的趨勢，蛋白質殘留率呈現逐漸下降的趨勢；當蛋白酶添加量超過0.018%時菱角多糖提取率升高趨勢緩慢，蛋白質殘留率降低也變緩慢。推測原因隨著蛋白酶添加量的不斷增加，使得整個體系中的可溶性大分子物質不斷增加，使得加入乙醇沉淀后總的可溶性物質增加，蛋白質酶解率不斷提高，考慮到蛋白酶的成本，選擇0.015%，0.018%，0.021%帶入正交試驗優化。

3.2 酶解溫度對菱角多糖提取的影響

酶解溫度對菱角多糖提取的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對菱角多糖提取的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，菱角多糖提取率與蛋白質殘留率呈現相反的趨勢；當酶解溫度為50℃時菱角多糖的提取率達到峰值，此時蛋白質殘留率最少。推測原因為蛋白酶的最佳酶活溫度為50℃左右，在此溫度下蛋白質酶解程度較高，菱角離心上清液中的多糖也不會因為酶解溫度的過高造成分解，導致菱角多糖提取率下降。因此，選擇40，50，60℃進行正交試驗。

3.3 酶解時間對菱角多糖提取的影響

酶解時間對菱角多糖提取的影響見圖3。

圖3 酶解時間對菱角多糖提取的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，菱角多糖提取率呈現先上升后下降的趨勢；而蛋白質殘留率呈現逐漸下降的趨勢，這與酶和長時間熱處理有關。蛋白酶酶解有助于菱角多糖的提取，但是隨著長時間的熱處理會引起多糖水解成小分子，從菱角多糖提取率及蛋白質殘留率的變化，綜合考慮后選擇1.0，1.5，2.0 h進行正交試驗。

3.4 酶解pH值對菱角多糖提取的影響

酶解pH值對菱角多糖提取的影響見圖4。

圖4 酶解pH值對菱角多糖提取的影響

3.5 正交優化試驗

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

由表2可知，對菱角多糖提取率影響最大的為蛋白酶添加量，其次為酶解時間，酶解溫度和酶解pH值對菱角多糖提取率影響較小，最佳的因子組合為A2B2C3D2，即蛋白酶添加量0.018%，酶解溫度50℃，酶解時間2 h，酶解pH值5時，可獲得較高的菱角多糖提取率。由于上述因素組合不在正交表中，進行驗證試驗，菱角多糖提取率為12.65%，其中蛋白質殘留率為1.08%。

3.6 菱角多糖羥基自由基清除能力

菱角多糖羥基自由基清除能力見圖5。

圖5 菱角多糖羥基自由基清除能力

由圖5可知，隨著菱角多糖質量濃度的不斷提高，羥基自由基清除率呈現逐漸上升的趨勢。菱角多糖質量濃度為1.5 mg/mL時，羥基自由基清除率達到56.8%；再繼續增加菱角多糖的質量濃度，羥基自由基清除率增長變緩；待菱角多糖質量濃度達到2.5 mg/mL時，羥基自由基清除率為69.7%。可見，菱角多糖具有較強的羥基自由基清除能力。

4 結論

采用蛋白酶酶解處理菱角上清液制備菱角多糖，并進行羥基自由基清除試驗。結果顯示，對菱角多糖提取率影響最大的為蛋白酶添加量，其次為酶解時間，酶解溫度和酶解pH值對菱角多糖提取率影響較小，最佳的因子組合為蛋白酶添加量0.018%，酶解溫度50℃，酶解時間2 h，酶解pH值5時，此時可獲得12.65%菱角多糖，其中蛋白質殘留率為1.08%。菱角多糖對羥基自由基具有較好的清除能力，并呈現一定的量效關系，菱角多糖質量濃度為1.5 mg/mL時，羥基自由基清除率達到56.8%。所制備菱角多糖中含有一定量的蛋白質，同時還含有一些其他水溶性成分，這些物質都會影響到其對羥基自由基的清除能力，需要進一步對其進行純化，以獲得更高純度的菱角多糖。

[1]林健.菱角多糖口服液制劑的研究 [D].長春：吉林大學，2011.

[2]李向紅，鄧放明，劉展.菱資源開發利用現狀與趨勢[J].中國食物與營養，2004（8）：26-28.

[3]彭靜，柯衛東，劉義滿，等.菱角的營養成分及醫藥保健作用 [J].長江蔬菜，2009（16）：17-19.

[4]盛占武，孫志高，鄯晉曉.菱角的保健功能及其產品開發進展 [J].食品研究與開發，2006，27（9）：160-164.

[5]馬萌，周惠明，朱科學，等.菱角中淀粉和蛋白的分離制備及性質研究 [J].食品工業科技，2013（9）：146-149，153.

[6]中華人民共和國衛生部.GB 5009.5—2010食品安全國家標準食品中蛋白質的測定 [S].北京：中國標準出版社，2010.

[7]劉志國，趙文亞.菱角殼粗多糖體外清除自由基活性的研究 [J].安徽農業科學，2012，40（22）：11 182-11 183，11 209.◇

Study on Polysaccharide Extraction from Water Chestnut

DONG Xiangdong1，2，*MENG Xiumei1，2，WANG Jingjing1，2，LI Minghua1，2，
（1.Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College，Huaian，Jiangsu 223003，China；2.Jiangsu Engineering Research and Department Center for Food Processing，Huaian，Jiangsu 223003，China）

Polysachharide is obtained from water chestnut residue with the method of protease hydrolysis.According to single factor and orthogonal test，the optimal conditions are protease 0.018%，temperature 50℃，time 2 h，pH 5.0.Under this condition，the extraction rate of the polysaccharide is 12.56%.The protein residue rate of the polysaccharide is 1.08%.When the polysaccharide concentration is 1.5 mg/mL，the hydroxyl radical scavenging rate is 56.8%.

water chestnut；polysaccharide；enzymatic method；extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.038

1671-9646（2017）01b-0009-03

2016-12-28

江蘇省高校大學生創新訓練計劃項目（201613104017X）。

董向東（1995— ），男，大專，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：孟秀梅（1980— ），女，碩士，副研究員，研究方向為食品生物技術。