星點設計-響應面法優化壯骨方煮散的煎煮工藝Δ

田元春，李雙蕾，楊 婧，吳麗如，鄧紫娉（.廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，南寧 530023；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科，南寧 530023）

星點設計-響應面法優化壯骨方煮散的煎煮工藝Δ

田元春1＊，李雙蕾2#，楊 婧1，吳麗如1，鄧紫娉1（1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，南寧 530023；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科，南寧 530023）

目的：優化壯骨方煮散的煎煮工藝。方法：采用2因素5水平星點設計試驗，以加水（倍）量和煎煮時間為自變量，以淫羊藿苷提取量和浸膏得率的總評“歸一值”為因變量，進行回歸方程擬合，采用響應面法優化壯骨方煮散煎煮工藝并進行驗證；將采用優化后煎煮工藝的煮散與傳統飲片的煎煮效果進行比較。結果：最優工藝為加16倍量水，煎煮2次，每次20 min；驗證試驗中“歸一值”預測值與理論值的相對誤差為2.97%；煮散與飲片經相同條件煎煮后淫羊藿苷提取量分別為1.234 3、1.132 4 μg/g，浸膏得率分別為23.73%、17.84%。結論：星點設計-響應面法優化煎煮工藝方法簡便、可靠，優化的煎煮工藝穩定、可行；壯骨方煮散煎出效果優于傳統飲片。

壯骨方；煮散；飲片；星點設計-響應面法；煎煮；工藝優化；淫羊藿苷；浸膏得率

中藥煮散是指將中藥材粉碎成一定粒度與水共煎，去渣取汁制成的中藥液體制劑[1]。其與湯劑一樣是中藥的傳統用藥形式，既保持了湯劑的特點，又具有煎出率高、節省藥材、煎煮時間短等優勢。壯骨方為廣西名中醫李雙蕾多年臨床積累的驗方，由淫羊藿、黃芪、丹參、杜仲、山藥等藥材組成，具有益腎填精、活血化瘀、通絡止痛之功，對糖尿病性骨質疏松癥有較好療效[2]；可使2型糖尿病模型大鼠血清胰島素樣生長因子1（IGF-1）水平升高、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平降低，促進骨形成、抑制骨吸收，改善糖尿病骨代謝進程[3]。本課題組擬將壯骨方制成煮散劑，以節約中藥資源、提高煎出效率、保證臨床療效、降低患者費用。淫羊藿為方中君藥，研究表明淫羊藿苷為抗骨質疏松作用的有效成分[4]。本研究以淫羊藿苷提取量和浸膏得率的總評“歸一值”為綜合評價指標，采用星點設計-響應面法優化壯骨方煮散的煎煮工藝，為壯骨方煮散的研制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

XFB-400B小型中藥粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）；GH-252分析天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器、LC Solution色譜工作站（日本島津公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

淫羊藿（批號：20151226）、黃芪（批號：20151223）、丹參（批號：20151211）、杜仲（批號：20151205）、山藥（批號：20151217）、三七（批號：20151226）均購自柳州神農中藥飲片廠，經廣西中醫藥大學第一附屬醫院黃權芳副主任中藥師鑒定均為2015年版《中國藥典》收載相應品種的真品；淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：MUST-15052801，純度：99.97%）；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 煮散的制備方法

壯骨方全方飲片總質量為105 g，依據宋代龐安時《傷寒總病論》提出的煮散“一方取半劑”的理論，稱取壯骨方全方處方的半劑飲片（飲片總質量52.5 g）。其中山藥粗碎，其余藥材分別于粉碎機中切割粉碎至過10目篩，并檢測能通過80目篩的細粉量＜10%，混合均勻，即得煮散。

2.2 淫羊藿苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 采用《中國藥典》條件[5]。色譜柱：Plastisil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護柱：Easy-Guard C18（10 mm×4 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（27∶73）；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min。理論板數按淫羊藿苷峰計應不低于1 500。取“2.2.2”“2.2.3”項下溶液（供試品為正交試驗7號）及除淫羊藿外的其余藥材制備的陰性樣品溶液進樣分析，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.2 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成284 μg/mL的溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取壯骨方煮散提取液經過濾后的續濾液濃縮定容至100 mL，得煮散液。精密吸取煮散液5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇約4 mL，超聲提取30 min，取出，放至室溫，加甲醇定容至刻度，離心（3 500 r/min，離心半徑為6.5 cm）5 min，取出。精密吸取上清液2 mL至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 標準曲線的繪制及方法學考察 分別精密吸取對照品溶液0.5、1、3、5、10、15、20、25 μL注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（A）對進樣量（X，μg）進行回歸，得淫羊藿苷線性回歸方程為A＝2 572 064X+27 344（r＝0.999 9），表明淫羊藿苷進樣量線性范圍為0.142～7.10 μg。按相關要求進行方法學考察，結果均符合規定。

2.3 浸膏得率的測定

精密吸取煮散提取液10 mL，置于已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干后移至烘箱中105℃干燥3 h。蒸發皿移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算浸膏得率（%）：（w×V）/（W×v）×100%，w為浸膏質量（g），W為藥材質量（g），V為樣品溶液的總體積，v為量取樣品溶液的體積。

2.4 星點設計-響應面法優化提取工藝

2.4.1 因素、水平及指標的確定 本課題組前期采用單因素法考察了影響壯骨方煮散煎煮效率的因素，結果提示加水量及煎煮時間是影響煎煮效率的主要因素，故本研究以加水量（X1）及煎煮時間（X2）為因素進行考察。根據預試驗分別設定其范圍為X1：10～20倍；X2：10～30 min。因煎煮次數為非連續變量，結合臨床補益類中藥方劑煎煮2次的實際情況，煎煮次數定為2次。以淫羊藿苷提取量（Y1）、浸膏得率（Y2）為考察指標，每個指標用Hassan法轉化為0～1的總評“歸一值”（OD）[6]：OD＝（d1×d2）1/2，d＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin）（其中，i為第i個樣品，Yi為選定的第i個樣品某個評價指標的實測值，Ymin為該評價指標實測值中的最小值，Ymax為該評價指標實測值中的最大值），OD越大表明提取效果越好。

2.4.2 試驗設計與結果 采用2因素5水平星點設計-響應面法優化煎煮工藝。因素與水平見表1，試驗安排與結果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 試驗設計與結果Tab 2 Test design and results

2.4.3 模型擬合與方差分析 采用Matlab 7.0.1軟件對試驗數據進行擬合。首先對各因素進行多元線性模型擬合后發現擬合度不好，故又采用二次多項式模型擬合，得回歸方程為OD＝0.344 6X1－4.374 4+0.191 8X2－0.001 3X1X2－0.008 8X12－0.003 9X22（r＝0.903 2，P＝0.016 6＜0.05），提示該煎煮工藝各項指標采用二次多項式模型較合適。在此基礎上再對模型進行進一步的優化，得到簡化的二次多項式方程為OD＝0.318 5X1－3.982 4+0.172 2X2－0.008 8X12－0.003 9X22（r＝0.900 4，P＝0.005 4＜0.01），此方程可信度較高，故以此二次多項式模型作為預測模型。對此模型采用F檢驗進行方差分析，結果顯示各因素對淫羊藿苷及浸膏得率的影響大小順序為X2＞X1，模型達到極顯著水平，詳見表3。

表3 方差分析結果Tab 3 Variance analysis results

2.4.4 工藝優化結果 根據上述二次多項式模型，繪制因變量隨自變量變化的三維響應面圖，詳見圖2。

圖2 響應面圖Fig 2 Response surface map

由圖2可知，隨著加水（倍）量和煎煮時間的增加，OD增加。最優區域OD＞0.7，選取較優范圍X1為14.7～21.5倍、X2為17.0～27.2 min。結合生產實際考慮，選定最優工藝為加水量為16倍，煎煮時間為20 min，煎煮2次。2.4.5 驗證試驗 稱取壯骨方煮散（飲片總質量52.5 g），按優化的煎煮工藝進行驗證試驗，重復3次。結果淫羊藿苷提取量分別為1.226 1、1.161 2、1.315 7 μg/g，平均值為1.234 3 μg/g；浸膏得率分別為23.91%、23.79%、23.47%，平均值為23.73%；計算OD分別為0.770 1、0.717 7、0.812 9，平均值為0.766 9，與預測值0.744 8的相對誤差為2.97%。以上表明建立的數學模型預測性較好，優化的工藝條件穩定、可行。

2.5 壯骨方煮散與傳統飲片煎煮效果比較

取半量壯骨方傳統飲片（飲片總質量52.5 g），加16倍水，煎煮2次，每次20 min，濾過，續濾液定容至100 mL，參照“2.2”“2.3”項下方法測定淫羊藿苷提取量和浸膏得率。重復3次，對比壯骨方煮散和傳統飲片煎出效率。結果壯骨方煮散煎液淫羊藿苷提取量（1.234 3 μg/g）是傳統飲片中淫羊藿苷提取量（1.132 4 μg/g）的1.09倍，煮散煎液浸膏得率（23.73%）是傳統飲片浸膏得率（17.84%）的1.33倍。因此，基于淫羊藿苷提取量和浸膏得率這2個指標，可認為壯骨方煮散煎出效率優于傳統飲片。

3 討論

據文獻報道，大多數淫羊藿藥材中朝藿定C含量較淫羊藿苷含量高[7-9]。本試驗采用的淫羊藿藥材在稀乙醇提取液中朝藿定C含量也較淫羊藿苷含量高。但筆者另外在預試驗中發現，在加水量相同的情況下，隨著煎煮時間的延長和煎煮次數的增加，煎煮液中朝藿定C提取量呈逐漸下降的趨勢、淫羊藿苷提取量呈小幅上升的趨勢；煮散煎煮40 min后，淫羊藿苷提取量大于朝藿定C提取量，這可能與朝藿定C結構不穩定有關。故本試驗最終選擇淫羊藿苷提取量為工藝考察指標。

由于工藝優化需考慮多個指標，而單個指標受因素的影響，不一定呈現相同的線性關系，指標之間也存在相互影響，最終選擇條件需要依據各項指標的綜合效應[6]。因此，本文采用OD表達最終效應，并建立數學模型進行優化與預測分析。

在同時考察多個因素對結果的影響的工藝篩選研究中，采用較多的方法有均勻設計和正交試驗設計，但這2類設計存在各因素間的交互作用考察不靈敏、試驗精度不夠、不能精確找到最佳點等問題[10]。因此，本文選用星點設計-響應面法，以二項式建立模型，此法精確度更高，試驗預測值更接近真實值。

煮散藥材的粉碎粒度并不是越小越好。壯骨方煮散中含有山藥，山藥富含淀粉，粒度過小易產生糊化作用，包裹在其他藥材的外層而不利于其他藥材有效成分的煎出。故本試驗采用山藥粗碎、其他藥材細碎的粉碎方法，結果較好。本課題組后續將側重研究壯骨方中每味藥材的最優粉碎粒度。

[1] 仝小林，張家成，穆蘭澄，等.恢復煮散節省藥材[J].中國新藥雜志，2012，21（5）：470-474.

[2] 李雙蕾，李巧云，羅廣波.壯骨方聯合鈣劑治療2型糖尿病合并骨質疏松癥療效觀察[J].遼寧中醫雜志，2008，35（2）：234-236.

[3] 粟麟，李雙蕾，陳文輝，等.壯骨方對糖尿病大鼠骨質疏松的防治及其對血清IGF-1、TNF-α水平的影響[J].中國骨質疏松雜志，2016，22（4）：428-432.

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[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：327.

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Optimization of Decoction Technology for Zhuanggufang Decoction Powder by Central Composite Designresponse Surface Method

TIAN Yuanchun1，LI Shuanglei2，YANG Jing1，WU Liru1，DENG Zipin1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Dept.of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China）

OBJECTIVE：To optimize the decoction technology of Zhuanggufang decoction powder.METHODS：Central composite design with 2 factors and 5 levels was conducted to design the test，taking water（fold）and decoction time as independent variables，the extraction amount of icariin and extraction yield overall desirability value of as dependent variables，regression equation were fitted；response surface method was used to optimize the decoction technology of Zhuanggufang decoction powder，and was verified.It was compared with the traditional decoction piece effect.RESULTS：The optimized technology was decocted twice with 16-fold water，20 min each time；relative error of predicted and theoretical value by overall desirability value was 2.97%；after decoction powder and piece decocted in the same conditions，the extraction amounts of icariin were 1.234 3 μg/g and 1.132 4 μg/g，extraction yields were 23.73%and 17.84%，respectively.CONCLUSIONS：Central composite design-response surface method optimizing decoction technology is simple and reliable，the optimized decoction technology is stable and feasible，and the decoction capability of Zhuanggufang decoction powder is better than the traditional pieces.

Zhuanggufang；Decoction powder；Decoction pieces；Central composite design-response surface method；Decoction process；Technology optimization；Icariin；Extraction yield

R284.2

A

1001-0408（2017）07-0954-04

2016-06-10

2016-08-12）

（編輯：劉 萍）

廣西科學研究與技術開發計劃項目（No.桂科攻14124004-1-26）；廣西名老中醫民族醫傳承工作室建設項目[No.桂衛中〔2014〕9號]

＊主任藥師。研究方向：臨床藥學、醫院藥學。電話：0771-5840015。E-mail：tianyc1989@163.com

#通信作者：主任醫師，教授。研究方向：內分泌及代謝性疾病。電話：0771-5848628。E-mail：lslei66@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.26