脾胃虛弱型肥胖小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)?

司原成，苗維納，何嘉悅，丁維俊

(成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610072)

脾胃虛弱型肥胖小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)?

司原成，苗維納，何嘉悅，丁維俊△

(成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610072)

目的:建立脾胃虛弱型肥胖小鼠模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:復(fù)制高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型，在肥胖模型的基礎(chǔ)上按照神疲乏力、食少納呆、便溏等主要脾虛指標(biāo)進(jìn)行二次篩選符合條件的肥胖鼠。通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白含量，測(cè)定血清中炎癥因子(白介素－6、白介素10及腫瘤壞死因子－α)及脾臟、胸腺和腸道派氏小體中CD4+、CD8+及CD11c+等含量變化。結(jié)果:肥胖鼠成模率62.96%，其中脾胃虛弱型肥胖鼠23.53%。脾虛型肥胖鼠IL－10、TNF－α顯著高于正常組，白介素－6顯著低于正常組，其腸道派氏小體中的CD4+、CD8+及CD11c+明顯降低。結(jié)論:此方法可以較好地篩選出脾胃虛弱型肥胖鼠，為健脾益氣治療肥胖奠定基礎(chǔ)。

脾胃虛弱;肥胖，動(dòng)物模型;乏力;含水量;免疫;

肥胖已經(jīng)成為全世界共同面臨的公共衛(wèi)生問(wèn)題。根據(jù)患者不同證候表現(xiàn)，中醫(yī)將肥胖分為脾胃虛弱、胃腸濕熱、脾腎陽(yáng)虛、肝膽郁熱等 5種證型［1－2］。然而，實(shí)驗(yàn)性肥胖動(dòng)物模型卻缺乏證候的關(guān)聯(lián)性研究。如何復(fù)制出符合中醫(yī)證型的肥胖動(dòng)物模型，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展中醫(yī)治療肥胖機(jī)理機(jī)制至關(guān)重要。為此，根據(jù)肥胖的中醫(yī)證候特點(diǎn)，我們?cè)诔Ｒ?guī)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，建立并評(píng)價(jià)適用于中醫(yī)證型的肥胖動(dòng)物模型。

脾胃虛弱型肥胖的主癥為神疲乏力、食少納呆、便溏等癥狀［3－5］，本實(shí)驗(yàn)從主癥著手，在肥胖模型復(fù)制成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)自主活動(dòng)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、每日進(jìn)食量及糞便含水量等，篩選出脾胃虛弱型肥胖鼠。然后，通過(guò)血脂4項(xiàng)、相關(guān)炎癥因子及免疫指標(biāo)，評(píng)價(jià)脾胃虛弱肥胖鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠150只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司(合格證號(hào)為SCXK(川) 2013－24)，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度23～25℃，濕度40%～60%，晝夜各半，7∶00～19∶00開(kāi)燈，19∶00～7∶00關(guān)燈。

1.1.2 試劑與儀器 總膽固醇ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)20160107)、甘油三酯ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)20160107)、高密度脂蛋白ELISA試劑盒(批號(hào)20160105)、低密度脂蛋白ELISA試劑盒(批號(hào)20160106)，南京建成生物工程研究所;白介素－6 ELISA試劑盒(批號(hào)21F011)、白介素－10 ELISA試劑盒(批號(hào)21F008)、腫瘤壞死因子－α ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)21F008)，依科賽生物科技有限公司; R＆D公司 CD4+ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào) ELQ1206b)、CD8+ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào) EL－Q1210b)、CD11c+ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào) ELQ1213b)。主要儀器為全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoFisher公司Varioskan)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取15只作為正常對(duì)照組，余下135只飼以高脂飲食，每籠5只。高脂飼料(配方:豬油32%，酪蛋白26%，麥芽糖糊精16%，蔗糖9%，纖維素6%，其他11%)［6］購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司(合格證編號(hào)SCXK(京)2014－0008)。每周固定時(shí)間測(cè)量其體質(zhì)量、體長(zhǎng)及腰圍等指標(biāo)。8周后，篩選出體質(zhì)量＞正常組平均體質(zhì)量+2SD，且Lee’s指數(shù)顯著高于正常組者，作為成功造模的肥胖鼠。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):將肥胖鼠放入曠場(chǎng)箱中，通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)，記錄肥胖鼠5 min內(nèi)在場(chǎng)箱中活動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、站立時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離，活動(dòng)度及站立次數(shù)小于正常組1倍標(biāo)準(zhǔn)差的定義為乏力鼠。

每日進(jìn)食量:每日早晨8∶00，稱(chēng)取記錄鼠籠食盒上剩余食物重量。每日進(jìn)食量小于正常鼠或者每日進(jìn)食量呈現(xiàn)先升高再降低的，定義為食少納呆鼠。

糞便含水量:每周定期采集肥胖鼠的新鮮糞便，稱(chēng)取糞便濕重和糞便干重，計(jì)算出糞便當(dāng)中的含水量［糞便含水量=(糞便濕重－糞便干重)/糞便濕重］。糞便含水量低于正常組1倍標(biāo)準(zhǔn)差的定義為便溏鼠。綜合以上3點(diǎn)，取三者的交集部分得到脾胃虛弱型肥胖鼠21只。

1.2.2 檢測(cè)方法 每日觀察實(shí)驗(yàn)鼠的精神狀態(tài)、毛色改變等變化并作詳細(xì)記錄。每周二固定時(shí)間測(cè)量實(shí)驗(yàn)鼠的體質(zhì)量、體長(zhǎng)、腰圍指標(biāo)。治療結(jié)束后禁食12 h，股動(dòng)脈取血離心分離血清。嚴(yán)格按照小鼠ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)詳細(xì)步驟操作，檢測(cè)血清中CHO、TG、HDL－C、LDL－C、IL－6、IL－10、TNF－α、的含量變化，觀察小鼠體內(nèi)脾臟、胸腺、腸道派氏小體中CD4+、CD8+、CD11c+的含量變化，使用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，采用單因素方差分析，2組間采用配對(duì)SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)及糞便含水量的變化

C57BL/6小鼠經(jīng)過(guò)8周飼養(yǎng)后，模型組的體質(zhì)量與Lee’s指數(shù)顯著高于正常組(P＜0.05)，表明模型鼠符合肥胖條件。模型組的糞便含水量明顯高于正常組(P＜0.05)，符合中醫(yī)便溏的中醫(yī)證型。

表1 2組小鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)的差異(±s)

表1 2組小鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)的差異(±s)

注:與正常組比較:?P＜0.05

2.2 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)

表2顯示，模型組小鼠在規(guī)定的5 min內(nèi)，其靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、處在九宮格中心位置的時(shí)間及角落時(shí)間均明顯差異于正常組(P＜0.05)，尤其是運(yùn)動(dòng)距離顯著低于正常組(P＜0.01)，表明神疲乏力的中醫(yī)證型復(fù)制成功。

表2 2組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)比較(±s)

表2 2組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)比較(±s)

注:與正常組比較:?P＜0.05;??P＜0.01

2.3 每日進(jìn)食量的差異影響

圖1顯示，2組小鼠飼養(yǎng)8周期間內(nèi)的每日進(jìn)食量可以看出，正常組的每日進(jìn)食量波動(dòng)不大，模型組的呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，表明起初小鼠對(duì)于高脂飲食比較偏愛(ài)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高脂飲食阻礙脾胃功能正常運(yùn)行，導(dǎo)致食欲下降，符合食少納呆的中醫(yī)證型。

圖1 飼養(yǎng)8周期間每日進(jìn)食量示意圖

2.4 小鼠血脂差異

表3顯示，模型組的總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)與正常組存在明顯差異(P＜0.05)，表明模型組血脂明顯高于正常組。模型組血清白介素－10(IL－10)及腫瘤壞死因子－α(TNF－α)顯著高于正常組(P＜0.01)，白介素－6(IL－6)顯著低于正常組，表明脾胃虛弱型肥胖存在低水平炎癥反應(yīng)。

表3 2組小鼠血脂4項(xiàng)及相關(guān)炎癥因子差異(±s)

表3 2組小鼠血脂4項(xiàng)及相關(guān)炎癥因子差異(±s)

注:與正常組比較:?P＜0.05;n=6

2.5 不同臟器中CD4+、CD8+、CD11c+的影響

表4顯示，脾臟、胸腺及派氏小體中 CD4+、CD8+及CD11c+的差異，模型組的脾臟CD4+顯著低于正常組(P＜0.01)，CD8+及CD11c+比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;胸腺中CD4+、CD8及CD11c+含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組的腸道派氏小體中CD4+顯著低于正常組(P＜0.05)，CD8+及CD11c+明顯高于正常組(P＜0.01)，表明脾胃虛弱型肥胖鼠存在腸黏膜免疫功能紊亂現(xiàn)象。

表4 2組之間不同免疫器官功能指標(biāo)的比較(±s)

表4 2組之間不同免疫器官功能指標(biāo)的比較(±s)

注:與正常組比較:??P＜0.01，?P＜0.05;n=6。

3 討論

肥胖有多種中醫(yī)證型，然而中醫(yī)治療肥胖的證型模型仍然面臨辨證與體征測(cè)試等多方面困難。小鼠屬于嚙齒目動(dòng)物，其生長(zhǎng)習(xí)性決定其進(jìn)食量增長(zhǎng)必然導(dǎo)致體質(zhì)量增長(zhǎng)，但是脾胃虛弱等原因又會(huì)使其進(jìn)食量下降，延長(zhǎng)造模時(shí)間甚至降低模型成功率。另一方面由于小鼠形體細(xì)小，舌象、脈象等難以辨識(shí)，給癥狀體征辨識(shí)帶來(lái)不少困難。

課題組通過(guò)參閱文獻(xiàn)［7－10］，結(jié)合中醫(yī)脾虛證候模型擬建立脾胃虛弱型肥胖模型，為中醫(yī)治療肥胖奠定基礎(chǔ)。首先，按照常規(guī)方法成功復(fù)制肥胖動(dòng)物模型，再結(jié)合中醫(yī)脾胃虛弱主癥(神疲乏力、食少納呆、便溏)篩選出脾胃虛弱肥胖鼠。神疲乏力使用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，觀察小鼠在規(guī)定的5 min內(nèi)其在場(chǎng)箱中的活動(dòng)，記錄其靜止不動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離、處在九宮格中心位置時(shí)間、角落位置時(shí)間及站立時(shí)間，綜合判斷其神疲乏力的狀況。其次，按照小鼠每日食物消耗量計(jì)算每只小鼠的進(jìn)食量，再將這些小鼠的進(jìn)食量求均值，繪制出如圖1所示示意圖。正常組每日進(jìn)食量相對(duì)穩(wěn)定，而模型組高脂飲食則呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，這符合小鼠的習(xí)性。高脂飼料富含大量油脂、蛋白質(zhì)、高糖深得小鼠喜愛(ài)，所以初次接觸進(jìn)食量增加，隨著長(zhǎng)時(shí)間大量高脂飲食攝入，導(dǎo)致腸胃吸收功能減弱，并開(kāi)始出現(xiàn)不思飲食、食少納呆等癥狀。這與中醫(yī)的脾虛證候類(lèi)似。因此將出現(xiàn)此種癥狀的肥胖鼠我們定義為食少納呆型肥胖鼠。第三，在飼養(yǎng)過(guò)程中時(shí)常見(jiàn)到部分小鼠有軟便或者稀便的出現(xiàn)，有人稱(chēng)之為“脂肪瀉”。大量高脂飲食的攝入使得小鼠的腸道出現(xiàn)功能性紊亂和吸收不完全，直接以脂肪的形式排出。便溏的設(shè)立，通過(guò)糞便含水量檢測(cè)來(lái)定量觀察肥胖鼠的便溏程度，將含水量高于正常鼠1倍標(biāo)準(zhǔn)差的肥胖鼠稱(chēng)之為便溏肥胖鼠。綜合以上3點(diǎn)，取三者的交集初步判定脾胃虛弱型肥胖鼠，之后再通過(guò)相關(guān)指標(biāo)來(lái)反證模型成功。

相關(guān)文獻(xiàn)表明［11］，脂肪組織血管具有聯(lián)通營(yíng)養(yǎng)和氧氣的網(wǎng)絡(luò)作用，其為脂肪組織提供營(yíng)養(yǎng)及氧氣，同時(shí)將自身合成的瘦素、脂聯(lián)素等脂肪激素輸送到血液中調(diào)節(jié)周身的脂質(zhì)代謝。在肥胖患者體內(nèi)，由于脂肪組織肥厚、血液灌注不足導(dǎo)致局部脂肪組織缺氧，促進(jìn)IL－6、IL－10、TNF－α等各種炎癥因子形成。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，肥胖鼠體內(nèi)在長(zhǎng)達(dá)8周高脂飲食刺激下出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，脂肪組織周?chē)装Y因子合成增多。

胸腺和脾臟分別是體內(nèi)中樞和外周的主要免疫器官，在維持機(jī)體正常免疫功能方面發(fā)揮作用。正常胸腺功能是保證人體內(nèi)成熟T細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)。脾臟則是具有免疫活性的T細(xì)胞移居和接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，且增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能［12］。T淋巴細(xì)胞參與機(jī)體的特異性免疫，在抗原刺激下前者轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞，通過(guò)釋放淋巴因子參與細(xì)胞免疫過(guò)程［13］。肥胖狀態(tài)下，小鼠體內(nèi)胸腺合成的CD4+、CD8+、CD11c+尚未完全分化成熟。至關(guān)重要的一點(diǎn)，肥胖免疫能力相對(duì)低下，存在一定免疫紊亂趨勢(shì)。然而在腸黏膜的派氏小體中，富集80%的淋巴細(xì)胞對(duì)抗腸道病原微生物保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在肥胖鼠腸黏膜派氏小體的離心組織液中得到CD4+、CD11c+含量較多，這與其腸黏膜時(shí)刻警戒腸道微生物密切相關(guān)。肥胖鼠體內(nèi)腸黏膜免疫的紊亂，使得防御病原微生物的能力下降出現(xiàn)抵抗不足現(xiàn)象，腸道微生物乘機(jī)侵襲機(jī)體，引起機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而使得白介素、腫瘤壞死因子等致炎因子含量增加，引起一系列生理病理變化并加重肥胖狀態(tài)。

綜上，課題組從中醫(yī)證型角度出發(fā)，結(jié)合現(xiàn)代肥胖的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，在肥胖模型復(fù)制成功的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選，篩選出符合脾胃虛弱的肥胖鼠，為開(kāi)展臨床研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為課題組探討健脾益氣針?lè)▽?duì)肥胖鼠慢性炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Establishment and Evaluation of Spleen Deficiency Syndrome Based on the Obesity Mice Model

SI Yuan－cheng，MIAO Wei－na，HE Jia－yue，DING Wei－jun△

(Fundamental department，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，610072，China)

Objective:To copy and evaluate the spleen deficiency syndrome type in obese mice.Method:Replicating obese mice with high－fat diet，and on this basis，according to the spleen deficient fatigue，less food，stay，loose stools and secondary screening eligible obese mice，and through the ELISA method to detect serum total cholesterol，triglycerides，high－density lipoprotein and low density lipoprotein content，observe serum inflammatory factors(interleukin 6，interleukin 10 and tumor necrosis factor alpha)and CD4+，CD8+，CD11c+content changes of the spleen，thymus and intestinal corpuscle.Results:The model of obesity mice was 62.96%，23.53%of which was spleen deficiency syndrome type.The IL－10，the TNF alpha of these mice is significantly higher than normal group，interleukin－6 was significantly lower than normal group.The CD4+，CD8+and CD11c+of their gut peyer’s patch were also significantly reduced.Conclusion:This method could better screen spleen deficiency syndrome by obesity animal medel.

Spleen deficiency syndrome type;Obesity;Animal models;Lack of power;Water content;Immune

R－332

A

1006－3250(2017)02－0177－03

2016－08－14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273899)－健脾益氣祛痰法對(duì)肥胖鼠腸黏膜TLRs的良性調(diào)控機(jī)制研究

司原成(1988－)，男，安徽阜陽(yáng)人，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)防治代謝性疾病的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。

△通訊作者:丁維俊(1967－)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)防治代謝性疾病的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究，E－mail: dingwj123@163.com。