白蘆藜醇對糖尿病小鼠腎臟內質網應激的影響

于中飛+劉魯英

[摘要] 目的 探討白蘆藜醇對糖尿病小鼠腎臟組織內質網應激的影響。 方法 8周齡C57bl/6小鼠腹腔注射STZ誘導糖尿病小鼠模型。將實驗動物分為正常對照組、糖尿病未治療組和糖尿病白蘆藜醇治療組。建模5個月后取腎臟組織行Western blot和RT-PCR檢測內質網應激通路關鍵分子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein， CHOP）與葡萄糖調節蛋白78（glucoseregulated protein78，GRP78）表達水平。免疫組織化學染色觀察腎臟組織CHOP的表達。結果 糖尿病白蘆藜醇治療組CHOP和GRP78表達水平相比糖尿病未治療組明顯減少（P<0.05），但兩者均高于正常對照組（P<0.05）。 結論 白藜蘆醇能明顯降低糖尿病小鼠腎臟內質網應激水平。

[關鍵詞] 糖尿病腎病 白蘆藜醇 內質網應激

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-4062（2016）12（b）-0072-03

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的代謝性疾病，作為糖尿病最主要的慢性并發癥之一[1]，糖尿病腎病已經成為糖尿病研究領域的重點。隨著我國糖尿病發病率的上升，糖尿病腎病目前已成為僅次于各種腎小球腎炎的終末期腎臟病的第2位原因[1-2]。糖尿病腎病的發病機制主要包括糖代謝紊亂所致的炎癥損傷，內質網應激，氧化應激以及血流動力學異常等[1-3]。由于其存在復雜的代謝紊亂，加之全身情況的異常，糖尿病腎病一旦發展到終末期，其治療往往比其他腎臟疾病更加棘手，因此及時防治對于延緩糖尿病腎病的進展意義重大。在該研究中，通過對糖尿病小鼠進行藥物干預，旨在探索白蘆藜醇治療對糖尿病腎病內質網應激的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

8周齡清潔級C57BL/6雄性小鼠（濟南鵬悅動物有限公司）50只，分為3組：正常對照組（10只），糖尿病未治療組（20只），糖尿病白蘆藜醇治療組（20只，于造模成功后1個月起每天給予白蘆藜醇灌胃40 mg/kg）。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ），兔抗小鼠CHOP和GRP78抗體，兔抗小鼠GAPDH抗體、Cy3標記羊抗兔IgG， RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒。

1.3 糖尿病小鼠造模

造模前C57bl/6小鼠過夜禁食，次日開始連續5 d腹腔注射鏈脲菌素（STZ）50 mg/kg。注射完成后7 d，采用割尾法取血，快速血糖儀檢測血糖，血糖值大于15.7 mmol/L為造模成功。每月進行監測血糖，不合格者淘汰出該實驗。

1.4 基因檢測

RT-PCR檢測內質網應激關鍵因子CHOP和GRP78的基因表達水平各組小鼠過量麻醉處死后，迅速取新鮮腎臟膜組織。總RNA提取以及逆轉錄均按照提取試劑盒和逆轉錄試劑盒說明步驟進行操作。基因表達水平相對定量采用2-ΔΔCT法分析。

引物序列：CHOP： F5‘-AGGAGGTCCTGTCCTCAGATGA-3，R 5‘-ATGTGCGTGTGACCTCTGTTG-3；GRP78：F 5‘- CTCCGGCGTGAGGTAGAAAA -3，R 5‘- AGAGCGGAACAGGTCCATGT -3；GAPDH：F： 5- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG -3；R： 5- GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG -3

1.5 Western Blot檢測內質網應激關鍵因子CHOP和GRP78的蛋白表達水平

取新鮮腎臟組織。提取蛋白，電泳后轉膜。一抗（CHOP---1：500，GRP78---1：500，GAPDH---1：2 000），4℃孵育過夜。HRP標記二抗（1：5 000），室溫孵育2 h。膠片顯影照相。

1.6 免疫熒光檢測

免疫組織化學染色觀察內質網應激關鍵因子CHOP和GRP78的表達取各組小鼠腎臟組織行冰凍切片，厚度為10 μm。常規免疫熒光法檢測。一抗為兔抗CHOP和GRP78抗體（1：100， 體積分數1%BSA+抗體，），二抗為Cy3標記羊抗兔IgG（1：100，體積分數1%BSA+抗體），細胞核染色為DAPI（1：5 000），封片后激光共聚焦熒光顯微鏡拍照。

1.7 統計方法

使用SPSS 15.0統計學軟件進行統計學分析，各組數據均以平均值±平均差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血糖和體重情況

3組小鼠取材前，血糖和體重檢測數據見表1（各實驗組小鼠已剔除血糖不合格者）。糖尿病組和白蘆藜醇治療組血糖水平明顯高于正常組（P<0.05），而體重相比正常組明顯減輕（P<0.05）。

2.2 各組小鼠腎臟組織CHOP和GRP78 mRNA相對表達量

糖尿病白蘆藜醇治療組小鼠腎臟組織中CHOP和GRP78的mRNA表達量明顯低于糖尿病未治療組，但兩者都高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖1。

2.3 各組小鼠腎臟組織CHOP和GRP78 蛋白表達量

糖尿病白蘆藜醇治療組小鼠腎臟組織中CHOP和GRP78的蛋白表達水平明顯低于糖尿病未治療組，但兩者都高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2。

2.4 各組小鼠腎臟組織CHOP和GRP78蛋白免疫熒光

糖尿病白蘆藜醇治療組小鼠腎臟組織中CHOP蛋白紅色熒光染色強度較糖尿病未治療組降低，但兩者熒光強度均高于正常組，見圖3。

3 討論

隨著糖尿病發病率的升高，其相關并發癥也越來越受到人們的重視。糖尿病腎病為其最主要的并發癥之一，近年來一直是研究的熱點。糖尿病腎病作為一種慢性進行性疾病，其發生發展機制的關鍵在于細胞內環境的穩態遭到破壞。內質網是一種廣泛存在于細胞中的細胞器，對蛋白質的合成加工起到十分重要的作用。內質網本身正常功能的維持具有極強的內在體系，當遭到其他有害因素刺激時則會發生內質網應激反應（ERS，endoplasmic reticulum stress）。ERS在生理病理條件下的作用有明顯差異，一定程度的ERS可能對細胞起保護作用，但是過度的ERS會加劇細胞損傷和細胞凋亡[4]。

機體在糖尿病狀態下造成ERS可能的刺激因素包括高血糖，炎癥反應，氧化應激，蛋白尿以及細胞內外電解質紊亂等。目前關于糖尿病腎病與內質網應激之間存在緊密關系的證據已經得到闡述[5-6]。有研究發現內質網應激與糖尿病發病的關鍵因素B細胞功能缺陷密切相關[7]。在體外實驗中發現腎小管上皮細胞用高糖刺激后，ERS相關指示因子 （CHOP、GRP78、氧調節蛋白150等）的表達均出現明顯升高；臨床檢測中也發現糖尿病腎病患者的腎組織中GRP78、氧調節蛋白150表達明顯增加，提示ERS的發生和腎臟損傷的程度有關[8]。

白蘆藜醇作為一種多酚化合物，具有抗氧化，清除自由基和抗內質網應激等多種藥理活性作用，對人體多個器官起到保護作用[9-10]。但白藜蘆醇對糖尿病腎病的保護機制中，扮演的阻斷或減輕內質網應激尚無較深入的研究。該研究中，驗證了白蘆藜醇對糖尿病腎病的保護作用，檢測了與其密切相關的內質網應激水平。結果顯示，白蘆藜醇可以明顯降低糖尿病腎臟組織的內質網應激水平。當然，該研究僅初步探索了白蘆藜醇降低內質網應激的藥理作用，其關鍵機制還未闡明。后續，將對白蘆藜醇的相關機制原理做進一步探索。

[參考文獻]

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（收稿日期：2016-10-23）