Noxa基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌的關(guān)系

朱衛(wèi)東，郭凌川

Noxa基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌的關(guān)系

朱衛(wèi)東，郭凌川

目的 探討Noxa基因與人肝癌的臨床病理關(guān)系及對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用。方法 采用免疫組化法檢測(cè)100例肝癌組織及癌旁組織中Noxa蛋白的表達(dá)，結(jié)合其臨床病理參數(shù)和隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí)利用脂質(zhì)體將真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-Noxa瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Noxa基因mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Noxa蛋白表達(dá)，MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示肝癌組織中Noxa陽(yáng)性率為50%，明顯低于癌旁正常肝組織(78%)，兩組相比差異有顯著性(P<0.05)。Noxa蛋白表達(dá)與肝癌分化程度及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。HepG2細(xì)胞中成功表達(dá)Noxa基因，轉(zhuǎn)染后mRNA及蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與其它各組相比，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，其吸光度值逐漸升高(P<0.05)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，其24 h、48 h、72 h凋亡率分別為(15.5±0.9)%、(24.6±0.8)%和(35.4±0.7)%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Noxa表達(dá)與肝癌分化程度及TNM分期密切相關(guān)，其高表達(dá)可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并促進(jìn)其凋亡。

肝腫瘤；肝細(xì)胞癌；Noxa；HepG2；凋亡；轉(zhuǎn)染

肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人民的身體健康[1-2]。現(xiàn)階段隨著各種治療方法的不斷提高，尤其是新的特異的靶向藥物的引進(jìn)，使得患者存活率有所提高，但其總體存活率并不樂(lè)觀。因此，探索新的靶點(diǎn)具有重要意義。Oda等[3]首次證明Noxa基因是BCL-2家族的促凋亡成員之一，并且是p53的下游靶基因之一。該基因定位于18q21-32，全長(zhǎng)4 301 bp，僅僅含有一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，所以將其歸類(lèi)于BCL-2家族的BH3亞家族成員。其可被p53基因誘導(dǎo)使其表達(dá)上調(diào)，因?yàn)镹oxa啟動(dòng)子上游有兩個(gè)p53結(jié)合位點(diǎn)，由此發(fā)揮凋亡作用[4-5]，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過(guò)依賴(lài)p53或者不依賴(lài)p53等多種途徑。目前以其促細(xì)胞凋亡理論為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了許多以分子靶向治療為手段的抗癌藥。Noxa又稱(chēng)APR(ATL-derived PMA-responsive gene)或PMAIP1(phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1)[6]，是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治療中起重要作用，但是關(guān)于Noxa介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制仍有許多不清楚之處。目前有關(guān)Noxa與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間關(guān)系的報(bào)道極少，有研究表明其與結(jié)直腸癌的惡性程度、侵襲力及預(yù)后可能相關(guān)[7]，本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)主要從基因的表達(dá)與臨床病理學(xué)及細(xì)胞學(xué)水平研究其與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科2010年9月～2011年12月手術(shù)切除的100例肝癌標(biāo)本，均經(jīng)病理確診。患者年齡32～77歲，男性60例，女性40例，男女比為3 ∶2；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期40例，Ⅲ+Ⅳ期60例；高+中分化80例，低分化20例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療，癌旁組織取自癌組織邊緣2 cm以外組織，標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑 Noxa單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HepG2細(xì)胞由蘇州大學(xué)提供；上海生物工程公司構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Noxa；上海生物工程公司合成Noxa基因和內(nèi)參照GAPDH的PCR引物；Lipofectamine 2000和Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR試劑購(gòu)自Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 按試劑說(shuō)明書(shū)行Noxa單克隆抗體免疫組化染色(EnVision法)，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為原則，計(jì)數(shù)10個(gè)400倍高倍視野，按陽(yáng)性強(qiáng)度計(jì)分：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中等陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。1～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，后期調(diào)整細(xì)胞濃度用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前于6、24及96孔板中每孔分別種(3.0～8.0)×105、(1～2.5)×104及(4～10)×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞達(dá)到70%～90%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，用Opti-MEMI稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，再將兩者混合，室溫放置20 min后加至6孔板中，6 h后換液。該實(shí)驗(yàn)分為三組，空白對(duì)照組：只接種細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP質(zhì)粒；陽(yáng)性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa。以上三組均分別培養(yǎng)24、48和72 h。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)Noxa mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染24、48和72 h后從6孔培養(yǎng)板收集各組細(xì)胞，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，利用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，其上游引物為5′-AAAGAAAGCCAGGAAGAATG-3′，下游引物為5′-TCAACTTGTCGCCAAAGC-3′，產(chǎn)物大小為101 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，下游為5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，產(chǎn)物大小為205 bp。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，凝膠成像，系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3.6 MTT比色試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔板中，(4 000～10 000)個(gè)細(xì)胞/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24、48和72 h后加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸掉上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于搖床上低速振蕩10 min，測(cè)量各孔的吸光度(A)值。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，從6孔板中收集所有懸浮及貼壁的細(xì)胞，離心后去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜后，離心后去除乙醇，加入RNase A(1 mg/mL) 20 μL，37 ℃水浴30 min后，再加入PI(100 μg/mL)染色液800 μL，混勻，4 ℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Noxa在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在100例肝癌組織中，Noxa陽(yáng)性率為50%(圖1)，在100例癌旁組織也有不同程度的表達(dá)，陽(yáng)性率為78%(圖2)，Noxa在肝癌組織中的陽(yáng)性率明顯低于癌旁組織(P<0.05)。Noxa表達(dá)與肝癌患者性別、年齡及腫塊大小無(wú)明顯特定關(guān)系，與TNM分期和分化程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果

2.2.1 轉(zhuǎn)染后Noxa mRNA的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出Noxa cDNA(圖3)。陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組無(wú)mRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后mRNA表達(dá)持續(xù)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

①②

圖1 Noxa蛋白在肝癌組織中的表達(dá)，EnVision法 圖2 Noxa蛋白在癌旁肝組織中的表達(dá)，EnVision法

*P<0.05

圖3 RT-PCR檢測(cè)Noxa mRNA表達(dá)

M.DNA Marker；1.對(duì)照組；2.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP組；3.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 72 h組；4.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 48 h組；5.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 24 h組

2.2.2 Western blot檢測(cè)Noxa蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組未見(jiàn)有目的蛋白特異條帶。經(jīng)成像系統(tǒng)分析，轉(zhuǎn)染24、48和72 h后蛋白表達(dá)量持續(xù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Noxa蛋白的表達(dá)

1.對(duì)照組；2.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP組；3.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 72 h組；4.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 48 h組；5.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 24 h組

2.3 Noxa表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞的增殖速度隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa后HepG2細(xì)胞OD值的變化

與空白組相比，*P<0.05

2.4 Noxa表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組凋亡率分別為(1.71±0.9)%、(2.62±0.8)%，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 24、48和72 h組凋亡率分別為(15.5±0.9)%、(24.6±0.8)%和(35.4±0.7)%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與空白組及陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

3 討論

目前放、化療一直是治療腫瘤的常規(guī)治療措施，現(xiàn)在基因治療及基因靶向治療成為治療腫瘤的一條嶄新途徑，并給腫瘤患者帶來(lái)新的希望。Noxa基因是BCL-2家族的促凋亡成員，可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，既可被p53基因誘導(dǎo)使其表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮凋亡作用[8]，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子E2F1、C-三肽分泌酶抑制劑(GSI)、缺氧、病毒感染和人類(lèi)腺病毒5型早期區(qū)域1A(E1A)等p53非依賴(lài)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期和凋亡A.空白組；B.陰性對(duì)照組；C.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 72 h組；D.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 48 h組；E.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Noxa 24 h組

有研究表明人乳腺癌細(xì)胞中使用腺病毒基因表達(dá)系統(tǒng)異位表Noxa基因，90%細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。Qin等[10-11]發(fā)現(xiàn)，硼替佐米能在不損傷正常黑素細(xì)胞的情況下殺傷黑素瘤細(xì)胞，其作用可能通過(guò)誘導(dǎo)不依賴(lài)p53的Noxa基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的；而在治療非小細(xì)胞肺癌中，該藥物可通過(guò)線粒體途徑上調(diào)Noxa促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。PS341(一種蛋白酶抑制劑)在人類(lèi)各種不同類(lèi)型的癌癥中均能誘導(dǎo)Noxa表達(dá)上調(diào)[12]。紫杉醇?xì)赶侔┘?xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，該凋亡可能與Noxa、Bim的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[13]。Meng等[14]通過(guò)小干擾RNA剔除發(fā)現(xiàn)，棉酚(BH3天然模擬藥物)治療前列腺癌主要抑制BCL-xL，上調(diào)Noxa和Puma來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Perez-Galan等[15]的研究指出在治療外套細(xì)胞淋巴瘤的過(guò)程中，GX15-070(BH3模擬藥物)可單獨(dú)或者與硼替佐米共同作用來(lái)上調(diào)Noxa基因的表達(dá)，從而激活Bak基因，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在治療神經(jīng)外胚層腫瘤(神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑素瘤)的過(guò)程中，抗腫瘤藥物芬維A胺以非依賴(lài)p53的方式使Noxa表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[16]。組蛋白脫乙酰基酶抑制劑主要使BCL-2家族抗凋亡成員失活及增加Bim和Noxa的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這一機(jī)制在治療慢性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤的過(guò)程中極大開(kāi)闊了臨床應(yīng)用前景[17]。

本實(shí)驗(yàn)分析了Noxa在肝癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,結(jié)果表明，Noxa表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期相關(guān);實(shí)驗(yàn)又從細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)一步研究其對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體將Noxa基因成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肝癌HepG2細(xì)胞中，利用MTT、流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制和凋亡作用。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Noxa基因的陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞的增殖抑制和凋亡明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組；這些結(jié)果表明Noxa表達(dá)與肝癌發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系，同時(shí)其表達(dá)可以抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。但其具體的分子作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，推測(cè)其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與p53基因或者線粒體途徑相關(guān)，至于其與Bim基因是否存在協(xié)同作用還有待進(jìn)一步的探討。相信不久的將來(lái)Noxa基因會(huì)成為人肝癌基因治療的新靶點(diǎn)。

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Correlation of the expression of Noxa with hepatocellular carcinoma

ZHU Wei-dong, GUO Ling-chuan

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China)

Purpose To explore the correlation of Noxa gene with clinical pathology and its effect on proliferation and apoptosis of HepG2 cells. Methods Noxa protein in 100 hepatocellular carcinoma tissues and 100 paracancerous tissues were detected by immunohistochemical technique, clinicopathological parameters and follow-up data were statistically analyzed. The recombinant eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-Noxa was transiently transfected into HepG2 cells with lipofectamine. Both Noxa mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot respectively. The inhibition of cell proliferation was evaluated by MTT assay. The cell apoptosis was detected by flow cytometry (FCM). Results Immunohistochemistry showed that in tumor tissue of hepatocellular carcinoma the positive rate of Noxa protein expression was 50%, while it was 78% in cancer adjacent normal mucosal tissue, with statistically significant difference (P<0.05). The expression of Noxa was related to TNM staging and the tumor differentiation. Exotic Noxa gene was expressed successfully in HepG2 cells after transfected with lipofectamine. The expression of Noxa mRNA and protein of HepG2 cells was significantly up-regulated after transfected 24 h, 48 h and 72 h (P<0.05). MTT assay showed that the Noxa expression inhibited HepG2 cell proliferation in a time-dependent manner for 24 h, 48 h and 72 h (P<0.05), which was significantly different from that of the control group (P<0.05). Apoptosis rate after transfected 24 h, 48 h and 72 h was (15.5±0.9) %, (24.6±0.8) % and (35.4±0.7) %, respectively. There were significant difference between Noxa and the control group (P<0.05). Conclusion The expression of Noxa in hepatocellular carcinoma tissue is closely related to TNM stage and the tumor differentiation. Noxa gene overexpression is able to effectively inhibit the proliferation and promote the apoptosis of HepG2 cell line.

liver neoplasms; hepatocellular carcinoma; Noxa; HepG2; apoptosis; transfection

時(shí)間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.012.html

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，蘇州 215000

朱衛(wèi)東，男，主管技師。E-mail: 16586088@qq.com

R 735.7

A

1001-7399(2017)02-0139-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.005

接受日期：2016-12-02