肝細胞癌中Dkk-3與Cyclin D1的表達及臨床意義

姚 楠，孫景秋，張 瓊

肝細胞癌中Dkk-3與Cyclin D1的表達及臨床意義

姚 楠1，孫景秋2，張 瓊1

目的 探討Dkk-3與Cyclin D1蛋白在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和癌旁組織中的表達，及兩者表達與臨床病理特征的相關性。方法 采用免疫組化法檢測80例HCC及癌旁組織中Dkk-3和Cyclin D1蛋白的表達。結果 Dkk-3蛋白在HCC組織中的相對表達值低于癌旁組織(P<0.05)；Cyclin D1蛋白在HCC組織中的相對表達值高于癌旁組織(P<0.005)；Dkk-3和Cyclin D1蛋白相對表達值均與組織分化程度有關(P均<0.05)；HCC組織中Dkk-3與Cyclin D1蛋白表達呈負相關(P=0.044，rs=-0.226)。結論 Dkk-3蛋白可能通過影響Cyclin D1蛋白的表達影響HCC的發生、發展；聯合檢測Dkk-3和Cyclin D1蛋白表達可能對HCC的診斷及預后判斷有一定參考價值。

肝腫瘤；Dkk-3；Cyclin D1；免疫組織化學

我國肝癌病死率位居癌癥的第3位，僅次于肺癌和胃癌。因此研究其發病機制，對于判斷其預后并指導治療有重要意義。Dkk(Dickkopf)家族通過結合Wnt受體復合體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low density lipid receptor related protein 5/6, LRP5 /LRP6)來抑制Wnt信號通路[1]。其中Dkk-3位于人類染色體11p15.1的位點，相對分子質量為3.8×104，除了家族共有的結構外還包括一個擴充的N連接區域和C連接區域[2]。研究發現Dkk-3于成年嚙齒類動物腦和成纖維細胞以及人腎上腺皮質中顯著表達[3]，同時在人類多種腫瘤組織和細胞株中表達均減弱和消失，包括前列腺癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6]、肺癌[7]、腎細胞癌[8]等。細胞周期蛋白D1是細胞周期素家族(Cyclin Ds)中與腫瘤關系最為密切的成員，其過度表達能引起細胞過度生長、轉化及癌變。作為一種公認的癌基因，Cyclin D1已被證實在多種腫瘤細胞中呈過表達[9]。目前，關于肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中Cyclin D1和Dkk-3蛋白表達之間關系的研究，國內外文獻報道較少，本實驗通過檢測80例HCC標本中Cyclin D1和Dkk-3蛋白表達，分析兩者之間的關系，并探討兩者與HCC發生、發展之間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科2010年1月～2012年12月存檔的HCC組織80例，其中男性60例，女性20例；年齡26～79歲，平均53歲。高分化18例，中分化36例，低分化26例；大肝癌63例，小肝癌17例。所有病例均經病理學證實為HCC，且術前均未行放、化療。另收集癌旁組織40例，均為距腫瘤組織2 cm以上的正常肝組織。HCC組織及癌旁肝組織均取自手術標本。收集臨床相關資料。

1.2 免疫組化 一抗多克隆兔抗人Dkk-3抗體購自上海聯碩寶為生物公司，EliVision試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。PAS染色液為蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科配制。組織采用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。4 μm厚切片，常規脫蠟、水化、3%H2O210 min阻斷內源性過氧化物酶，高溫高壓修復10 min，按1 ∶100稀釋度滴加Dkk-3抗體后，按試劑盒說明書進行免疫組化染色操作。DAB顯色，蘇木精復染。采用已知陽性片作為對照組，以PBS代替一抗作為空白對照組。

1.3 結果判定 Cyclin D1和Dkk-3蛋白均定位于細胞核，以染色呈棕黃色為陽性。采取二次計分法：每例標本隨機選取10個高倍視野(×400)，計數每個高倍視野中陽性細胞所占百分比計分。(1)按染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞百分比計分：陰性為0分，陽性細胞數<10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩項得分結果相乘：≤1分為陰性，>1分為陽性。免疫組化標記結果由兩位病理醫師采用獨立雙盲法判定。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，不同組間比較采用χ2檢驗及Spearman等級相關檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dkk-3蛋白在HCC及癌旁組織中的表達 Dkk-3在HCC組織中的陽性率為26.3%(21/80)(圖1、2)，而在癌旁組織中的陽性率為57.5%(23/40)，Dkk-3在HCC組織中的表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05，表1)。

2.2 Cyclin D1在HCC及癌旁組織中的表達 Cyclin D1在HCC組織中的陽性率為47.5%(38/80)(圖3)，而癌旁組織中的陽性率較低，僅為22.5%(9/40)，組間相比差異有顯著性(P<0.05，表1)。

圖1 Dkk?3在高分化HCC中的表達，EliVison法圖2 Dkk?3在低分化HCC中的表達，EliVison法圖3 CyclinD1在HCC中的表達，EliVison法

表1 Dkk-3和Cyclin D1在HCC及癌旁組織中的表達

2.3 HCC中Dkk-3、Cyclin D1表達的相關性 Dkk-3和Cyclin D1蛋白表達均與組織分化程度有關(P均<0.05)；與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(表2)。對兩者陽性表達強度之間的相關性比較得出，Dkk-3和Cyclin D1蛋白在HCC組織中的表達呈負相關(P=0.044，rs=-0.226，表3)。

表2 Dkk-3和Cyclin D1表達與HCC臨床病理特征的關系

表3 HCC中Dkk-3、Cyclin D1表達的相關性

3 討論

HCC是常見的消化系統惡性腫瘤，其發生、發展是多步驟、多基因突變的過程。經典的Wnt/β-catenin信號通路的異常持續激活被認為與許多惡性腫瘤的發生、發展有關，其中包括HCC[10]。

有研究者認為，Dkk-3蛋白作為一個抑癌基因，可能通過下調β-catenin實現對Wnt通路的抑制作用[11]，從而起到抑制腫瘤發生、發展的作用。Dkk-3表達下調可能與啟動子的甲基化有關。在多種腫瘤細胞株中Dkk-3表達均明顯降低，實驗證實，經腺病毒載體轉染Dkk-3基因使其在腫瘤細胞高表達后可誘導腫瘤細胞的凋亡[12]。但其與肝癌的關系并未深入研究，國內僅見個別報道，且在蛋白表達水平上存在差異?；诖?，本組實驗通過免疫組化對比HCC及正常肝組織中Dkk-3蛋白表達差異及其與臨床病理特征之間的關系，了解其與HCC發生、發展之間的關系。結合國內外文獻報道與本組實驗結果，不難推測，Dkk-3與原發性肝癌的發病機制有著密切的關系。同時作者推測，通過促進癌細胞Dkk-3的表達，抑制Wnt通路的異?；罨型蔀橹委熌[瘤的一條新途徑。

Cyclin D1蛋白是Wnt通路上重要的調節蛋白，可以在G1期激活周期素依懶性激酶CDK4的活性，促進細胞進入S期。因此，其過表達可以使細胞縮短由G1期進入S期的時間，使細胞快速增殖從而形成腫瘤，被認為是與腫瘤發生有密切關聯的癌基因[13]。本組實驗中Cyclin D1蛋白表達在HCC組織中明顯升高，在HCC和癌旁組織中的表達差異有統計學意義，說明Cyclin D1蛋白表達上調與HCC的發生密切相關。Cyclin D1蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期無關。Cyclin D1是Wnt通路中的核心環節[14]。本實驗在對Dkk-3蛋白和Cyclin D1在HCC組織中表達的免疫組化檢測結果進行的相關性分析中，發現兩者蛋白表達呈負相關，即隨著Cyclin D1蛋白表達的升高，HCC組織中的Dkk-3蛋白表達持續降低。

綜上所述，作者認為在HCC發生、發展過程中，Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白共同作用在Wnt通路上，Dkk-3通過抑制Dsh蛋白的活化對Wnt信號轉導通路起抑制作用[15]，而β-catenin與Cyclin D1促進子序列結合，可增加Cyclin D1的轉錄。作者推測Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白在Wnt通路中為上下游關系，且兩者可能起到拮抗作用。因此，聯合檢測HCC中Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白表達，將有助于評估HCC的惡性程度及患者預后。

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Expression of Dkk-3 and Cyclin D1 protein in hepatocellular carcinoma and their clinical significance

YAO Nan1, SUN Jing-qiu2, ZHANG Qiong1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofNuclearMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233003,China)

Purpose To investigate the expression of Dkk-3 and Cyclin D1 protein in human hepatocellular carcinoma(HCC) and clinical significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect Dkk-3 and Cyclin D1 protein expression level in 80 cases of hepatocellular carcinoma and corresponding para-cancer tissue. Results The expression of Dkk-3 in hepatocellular carcinoma was significantly lower than those in corresponding para-cancer tissue (P<0.05) and the expression of Cyclin D1 in hepatocellular carcinoma was significantly higher than those in corresponding para-cancer tissue (P<0.05). The up-regulation of Cyclin D1 and the down-regulation of Dkk-3 proteins were correlated with pathologic differentiation degree (P<0.05). There was a significant inverse correlation between Dkk-3 and Cyclin D1 expression (P=0.044,rs=-0.226). Conclusion The abnormal expression of Dkk-3 and Cyclin D1 gene in human hepatocellular carcinoma suggest that Dkk-3 and Cyclin D1 gene may play an important role in the development and progression of the cancer. The combination detection of the two biomarkers may provide valuable data for diagnosis and prognosis estimation of HCC.

hepatocellular neoplasms; Dkk-3; Cyclin D1; immunohistochemistry

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.020.html

蚌埠醫學院校級課題基金(Byky1316)

安徽省蚌埠醫學院第一附屬醫院1病理科、2核醫學科， 蚌埠 233003

姚 楠，女，講師。E-mail: yaonan1979@126.com

R 735.7

A

1001-7399(2017)02-0158-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.009

接受日期：2016-11-22