FR顯色劑在含色素組織免疫組化染色中的應用

林 蓁

FR顯色劑在含色素組織免疫組化染色中的應用

林 蓁

色素； FR顯色劑；免疫組織化學

免疫組化染色技術在現代病理診斷工作中起著十分重要的作用。了解常規HE染色無法區分或較難辨別的情況，為病理腫瘤的鑒別診斷、預后判斷提供不可或缺的重要依據。但在一些病理組織標本中含有與免疫組化陽性顆粒相近的色素，如黑色素。這些色素沉積若大量存在會不同程度遮蓋組織細胞的結構與形態。特別是免疫組化染色時會與DAB顯色的陽性顆粒相互干擾，難以區分。對免疫組化結果判讀造成一定的影響。這就需要有一些辦法來解決。傳統的方法存在不少限制。根據病理診斷的需要及染色技術的許可性，我科對含有較多色素的組織運用羅氏免疫組化ultra View Universal AP Red Detection Kit(AP染色液)來標記。FR顯色，陽性顆粒為玫紅色，定位準確、清晰可辨，與組織原含色素顆粒顏色對比鮮明。標記效果佳，能較好解決上述問題，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集廈門大學附屬成功醫院病理科2015年間存檔的含有色素組織標本20例。

1.2 方法

1.2.1 組織處理與分組 標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟浸泡后包埋制成蠟塊。將蠟塊3 μm厚切片，裱在防脫載玻片上，每個蠟塊切3張切片，65 ℃ 30 min烤片待用。每個蠟塊3張切片均分3組，第一組HE染色，第二組免疫組化標記DAB顯色，第三組免疫組化標記FR顯色。

1.2.2 免疫組化 使用羅氏BenchMark XT免疫組化全自動染色儀，一組采用ultra View Universal DAB Detection Kit，DAB染色液(主要試劑包含：3%過氧化氫液，通用HRP多聚體，DAB顯色劑，5 g/L硫酸銅液)；另一組采用ultra View Universal AP Red Detection Kit，AP染色液(主要試劑包含：通用AP多聚體，快紅A、快紅B顯色劑，11%氯化鎂液)。上述染色試劑盒均購自羅氏診斷產品(上海)公司；一抗包括Melan-A、HMB-45、CKpan、Ki-67均購至福州邁新公司。根據預先優化好的程序，打印并貼好條形碼上機操作。染色程序結束后，少許稀釋洗潔精去除油膜，清水將切片清洗干凈。DAB顯色切片用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。FR顯色切片不可使用乙醇類脫水劑脫水。用水性封片劑封固，也可用電吹風微風吹干或自然晾干，中性樹膠封固。

1.2.3 結果判斷 CKpan陽性顆粒定位于胞質、Ki-67陽性顆粒定位于胞核、Melan-A陽性顆粒定位于胞質、HMB-45陽性顆粒定位于胞質。第1組：HE染色，可見切片較多原含色素顆粒。第2組：免疫組化染色，采用DAB顯色，陽性顆粒顯示棕褐色。第3組：免疫組化染色，采用FR顯色，陽性顆粒顯示玫紅色。

2 結果

第1組：HE染色可見組織切片中原含色素量較多(圖1)，可作對照。第2組：采用ultra View Universal DAB Detection Kit染色系統(DAB染色液)，可見DAB顯色陽性顆粒為棕色，與組織中原含色素顏色接近，不易辨認(圖2)。第3組采用ultra View Universal AP Red Detection Kit(AP染色液)，FR顯色陽性顆粒為鮮艷的玫紅色，定位準確，背景清晰(圖3)，與標本中原所含的色素(黑色、褐色、棕色等)形成鮮明對比，很容易做出分辨，大大提高免疫組化陽性判讀準確率。

圖1 皮膚組織切片：HE染色可見較多明顯的黑色素顆粒圖2 皮膚組織切片：免疫組化標記Melan?A，DAB顯色陽性顆粒棕褐色與組織原有的色素顆粒顏色接近，較難辨認，ultraViewUniversalDABDetectionKit染色 圖3 皮膚組織切片：免疫組化標記Melan?A，FR(A+B)顯色陽性顆粒玫紅色，表達清晰。與組織原有的色素顆粒棕褐色，對比分明，辨識度高，利于判讀，ultra View Universal AP Red Detection Kit染色系統染色

3 討論

許多色素在常規HE切片上看上去相似而不易區分，通常需要采用各種特殊染色方法以確定色素性質[1]。常見含鐵血黃素、黑色素或其他色素(脂褐素、膽色素、甲醛色素、碳顆粒等)。色素含量較多時，常覆蓋在組織細胞上，遮蓋了組織細胞的結構與形態，特別在免疫組化標記判讀時造成一定的干擾。

傳統的一些方法中，較具代表性的是對含有黑色素的組織切片進行祛黑色素，再進行免疫組化染色。黑色素十分穩定，完全不溶于水及有機溶劑，但長時間在強堿中則可被溶解，其可被強氧化劑如過氧化氫和高錳酸鉀等脫色質[2]。最常用的祛黑色素法是使用強氧化劑，如高錳酸鉀脫去黑色素，再用草酸褪去高錳酸鉀的顏色；郭以河等[3]報道改良方法。祛黑色素方法較費時，不易掌握使用程度。使用強氧化劑處理后的組織玻片，防脫片作用減弱許多，該方法最終的效果不佳，組織切片在免疫組化抗原修復及后續的過程中有不同程度的脫片現象。

在一定耐受空間內，組織抗原不會過多丟失，只是估計抗原丟失的可能，對其丟失程度無法量化。強氧化劑的過度處理對組織切片中的抗原、抗體均會產生一定程度影響，在免疫組化標記中較難得到滿意的效果。另外，組織所含色素顆粒種類較多，如遇到肺碳顆粒沉著色素，即使強氧化劑高錳酸鉀也無法褪去，也不易用其他方法處理褪去，這就需要有其他的方法來解決問題。

本文使用羅氏BenchMark XT全自動免疫組化染色儀，采用AP染色液，通過沉積紅色有色沉淀物使特異性抗原的位點顯色，有效避免了組織切片中原含色素的干擾，陽性顆粒表達為玫紅色，重現性強，結果穩定。光鏡觀察，切片常溫可長期保存。根據需要選擇抗體，陽性顆粒顯示的色彩與標本組織中所含色素(黑色、褐色、棕色等)對比鮮明，不會互相干擾。結果觀察表明，DAB染色液換成AP染色液，FR顯色較DAB顯色結果，更能區別組織中原有的色素顆粒。方法無需進行復雜的祛黑色素步驟，也避免了抗原、抗體丟失或減弱等顧慮，免疫組化染色步驟及時間并未增加，免疫組化染色效果明顯更佳。

需要注意的是，FR顯色后組織切片需用水洗，接觸乙醇類脫水劑可使標記的紅色陽性顆粒褪去，令實驗失敗。可參考ultra View Universal DAB Detection Kit的修復、孵育時間等，且必須設置陰性、陽性對照，優化好的程序可用在ultra View Universal AP Red Detection Kit。免疫組化標記的判讀，在光鏡下觀察，先確定陰性、陽性對照表達清晰易辨，定位正確，才可對檢測的組織切片進行判讀。對原含色素的組織，參考HE切片了解組織原含色素顆粒的定位及強弱，確定標記抗體陽性定位，客觀地對表達結果的正確性進行分析。對定位或顯色不正確的應重新進行染色。有時候細胞中堆積過量色素，會妨礙抗體與細胞中抗原的結合，造成假陰性或染色減弱，就是更換成FR顯色劑也解決不了這個問題時，脫色素具有必要性。

在病理工作中還會遇見其他色素，如肺碳顆粒沉著(黑色)、含鐵血黃素(黃棕色)等。近年來，我們在工作實踐中不斷的探索和嘗試，上述方法也可推廣應用到其它色素免疫組化染色中。正確規范化操作，注意質量控制，盡可能使實驗條件最優化，得到滿意結果。將優化程序相對固定下來，并在以后的染色中觀察變化，并不斷完善，細致的工作才能得到較滿意的實驗結果。

[1] 來茂德. 病理高級教程[M]. 北京: 人民軍醫出版社, 2013:691.

[2] 梁英杰, 凌啟波, 張 威. 臨床病理學技術[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2011:161-162.

[3] 郭以河, 張閩峰, 孟家榕, 等. 快速祛除組織中黑色素的改良方法[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2011,27(2):214.

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.058.html

廈門大學附屬成功醫院病理科，廈門 361003

林 蓁，女，副主任技師。E-mail: xmlinzhen@139.com

R 446

B

1001-7399(2017)02-0217-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.026

接受日期：2016-09-21