多發性骨髓瘤中c-myc和MDM2蛋白的表達及其臨床意義

趙志華，田 研，陳奎生

多發性骨髓瘤中c-myc和MDM2蛋白的表達及其臨床意義

趙志華，田 研，陳奎生

目的 探討c-myc蛋白及小鼠雙微體基因(murine double minute 2, MDM2)蛋白在多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中的表達及其與臨床分期的相關性。方法 采用免疫組化SP三步法檢測60例不同臨床分期MM組織和10例非腫瘤骨髓組織中c-myc蛋白及MDM2蛋白的表達。結果 c-myc蛋白在MM及非腫瘤骨髓組織中的陽性率分別為71.7%、10.0%，MDM2蛋白在MM及非腫瘤骨髓組織中的陽性率分別為80.0%、20.0%，兩者在MM及非腫瘤骨髓組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05)。兩者表達與MM的臨床分期呈正相關性(P<0.05)，與MM患者性別、年齡無相關性。MM中c-myc蛋白和MDM2蛋白的表達呈正相關(P<0.05)。結論 c-myc蛋白和MDM2蛋白在MM中高表達，其可能與MM的發生及臨床分期有關；在MM中，c-myc蛋白和MDM2蛋白可能具有協同作用，共同促進腫瘤的發展。

骨腫瘤；多發性骨髓瘤；c-myc蛋白；MDM2蛋白；臨床分期

c-myc基因是myc癌基因家族成員之一，其異常表達在調節細胞的惡性轉化、生長及分化中發揮重要作用；小鼠雙微體基因(murine double minute 2, MDM2)是一種原癌基因，其通過激活E2F-1可以促進細胞G1→S期的轉變，通過抑制野生型p53的功能可以調控細胞的增殖、凋亡。c-myc或MDM2蛋白在許多惡性腫瘤內有較高的表達水平，因此，靶向作用于c-myc或MDM2及其相關基因有可能成為腫瘤治療的有效途徑之一。c-myc蛋白或MDM2蛋白在多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中表達的報道較少[1-3]，聯合檢測c-myc和MDM2蛋白在MM組織中的表達，目前尚未見相關報道。本文旨在探討c-myc和MDM2蛋白在不同臨床分期MM中的表達，以期了解兩者在MM發生、發展中的意義及其與臨床分期的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取鄭州大學第一附屬醫院2013年8月～2015年12月期間存檔的MM石蠟標本60例，以及非腫瘤骨髓組織石蠟切片10例，均有完整的臨床病理資料，診斷均符合國內MM的診斷標準。60例MM中，男性34例，女性26例，年齡24～84歲，中位年齡59歲。根據國際分期系統(international staging system, ISS)標準對MM病例進行分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期18例，Ⅲ期24例。10例非腫瘤骨髓組織標本中，男性3例，女性7例，年齡15～74歲，中位年齡56歲。

1.2 試劑 兔抗c-myc多克隆抗體和鼠抗MDM2單克隆抗體均購于上海邁新生物公司，通用型SP三步法試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋公司。

1.3 方法 所有MM及非腫瘤骨髓組織標本均經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后制片。應用免疫組化SP三步法進行檢測。實驗采用檸檬酸高壓抗原熱修復法進行抗原修復，3%H2O2室溫孵育20 min，以滅活其過氧化物酶活性，PBS液沖洗，正常山羊血清工作液室溫孵育20 min，滴加一抗，4 ℃冰箱過夜12 h，PBS液沖洗，滴加通用型二抗，室溫孵育25 min，PBS液沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育25 min，PBS液沖洗并用DAB顯色液顯色，最后用蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。

1.4 結果判斷 參照半定量積分法進行結果判讀。每張切片隨機選取10個高倍視野觀察，按腫瘤細胞著色深淺分成4個等級：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞占腫瘤細胞百分比分成5個等級：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相加：0～1分為(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性()，6～7分為強陽性()，其中(+～)均判讀為陽性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件處理數據，對計數資料采用χ2檢驗，對相關性分析采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 c-myc和MDM2蛋白在MM及非腫瘤骨髓組織中的表達 c-myc蛋白陽性表達主要位于腫瘤細胞核(圖1)，MDM2蛋白陽性表達主要位于腫瘤細胞胞核和胞質(圖2)，兩者在非腫瘤骨髓組織中可呈散在的細胞陽性(圖3、4)。c-myc和MDM2蛋白在MM與非腫瘤骨髓組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 c-myc和MDM2蛋白在MM和非腫瘤骨髓組織中的表達(%)

*P<0.05，**P<0.05

2.2 c-myc和MDM2蛋白在不同臨床分期MM組織中的表達及其相關性 c-myc蛋白與MM臨床分期的相關系數r=0.431，P<0.05，即c-myc蛋白表達與MM臨床分期有相關性；MDM2蛋白與MM臨床分期的相關系數r=0.389，P<0.05，即MDM2蛋白表達與MM臨床分期有相關性(圖5、6，表2)。

表2 c-myc和MDM2蛋白在不同臨床分期MM組織中的表達(%)

2.3 c-myc和MDM2蛋白的表達與MM臨床參數的關系 c-myc和MDM2蛋白表達均與MM患者性別、年齡無相關性(P>0.05，表3)。

2.4 MM中c-myc和MDM2蛋白表達的相關性 經Spearman等級相關性分析，結果提示c-myc與MDM2蛋白表達呈正相關(r=0.316，P<0.05)。

3 討論

表3 c-myc、MDM2蛋白表達與MM臨床參數的關系(%)

MM是起源于骨髓中B淋巴細胞的單克隆漿細胞惡性腫瘤，是最常見發生于骨的淋巴造血系統腫瘤。據統計，MM占所有腫瘤的1.0%，占血液系統疾病惡性腫瘤的10%[4]。隨著我國人口平均壽命的延長，MM的發病率逐年增加，嚴重威脅人類的身心健康和生命。目前其治療主要依靠硼替佐米等藥物以及造血干細胞移植術，但這并不能達到臨床治愈的目的。由于MM發病機制不清，無法治愈，尤其是臨床分期越高，預后越差。因此探討MM的發生、發展機制，尋找其臨床治療的可能靶點及預后判斷指標成為當前的研究熱點。

c-myc基因是myc癌基因家族成員之一，也是myc家族中涉及到惡性腫瘤發展的最主要致癌基因，其在細胞的生長調控中起到關鍵作用。c-myc基因可以促進細胞的增殖，抑制細胞的分化，而且c-myc異常表達的產物在調節細胞的惡性轉化中發揮重要作用[5-6]。c-myc還可以調控細胞的周期[7]，其可以促使細胞由G1期進入S期，進而激活DNA的合成，促進細胞周期的進程。Zeng等[8]通過免疫組化檢測c-myc蛋白在前列腺癌的表達及其與預后的關系，發現c-myc蛋白在前列腺癌中高表達，并且與臨床分期相關，提示c-myc蛋白與前列腺癌的發生及預后有相關性。本組實驗對MM及非腫瘤骨髓組織中c-myc蛋白表達進行檢測，結果顯示，c-myc蛋白在MM中的陽性率為71.7%，非腫瘤骨髓組織中c-myc蛋白陽性率為10.0%，其在MM與非腫瘤骨髓組織的表達差異有統計學意義，提示c-myc蛋白與MM的發生可能有一定關系。c-myc蛋白與MM臨床分期的相關系數r=0.431，P<0.05，可認為c-myc蛋白表達與MM的不同臨床分期密切相關，在腫瘤中隨著分期的增加，其陽性率增高，提示c-myc蛋白與MM預后相關，陽性率越高，其預后越差。本組實驗結果與Zeng等[5]研究報道一致，進一步證實c-myc與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，深入研究c-myc依賴的細胞周期調控機制，將有助于惡性腫瘤治療靶點的發現。

圖1 c-myc蛋白在MM中的表達，SP9000三步法 圖2 MDM2蛋白在MM中的表達，SP9000三步法 圖3 c-myc蛋白在非腫瘤骨髓組織中的表達，SP9000三步法 圖4 MDM2蛋白在非腫瘤骨髓組織中的表達，SP9000三步法 圖5 c-myc蛋白在不同臨床分期MM中的表達：A.Ⅰ期；B.Ⅱ期；C.Ⅲ期，SP9000三步法 圖6 MDM2蛋白在不同臨床分期MM中的表達：A.Ⅰ期；B.Ⅱ期；C.Ⅲ期，SP9000三步法

MDM2是一種原癌基因，最初是從含有雙微體的小鼠成纖維母細胞中克隆出的一個高度擴增的基因[9]。其可以誘導細胞由G1期進入S期[10]，進而促使細胞進入細胞周期的循環。MDM2常常抑制野生型p53介導的細胞凋亡，進而提高細胞的生存率。MDM2是一個重要的p53負向調節器，其主要功能是降低p53蛋白的水平并抑制其活性[11-13]。因而，MDM2既可以促進細胞的增殖又可以促進細胞的存活。Sugano等[14]采用RT-PCR法檢測結直腸癌中MDM2基因的擴增，發現MDM2的高表達與結直腸癌的臨床分期相關，其陽性率越高，預后越差。本組實驗對MM及非腫瘤骨髓組織中MDM2蛋白表達進行檢測，結果顯示，MDM2蛋白在MM中的陽性率為80.0%，非腫瘤骨髓組織中MDM2蛋白陽性率為20.0%，其在MM與非腫瘤骨髓組織的表達差異有統計學意義，提示MDM2蛋白與MM的發生可能有一定關系。MDM2蛋白與MM不同臨床分期的相關系數r=0.389，P<0.05，可以認為MDM2蛋白表達與MM的臨床分期密切相關，隨著分期的增加，其陽性率增高，提示MDM2蛋白與MM預后相關，陽性率越高，其預后越差。本組實驗結果與Sugano等[14]的研究結果一致，進一步證實了MDM2基因在惡性腫瘤的發生、發展過程中起重要作用。

苗海港等[15]應用免疫組化法對脂肪瘤和原發性腹膜后脂肪肉瘤組織中c-myc蛋白及MDM2蛋白表達進行檢測，發現c-myc蛋白及MDM2蛋白在原發性腹膜后脂肪肉瘤中高表達，且c-myc蛋白與MDM2蛋白的表達呈正相關，提示在脂肪肉瘤的發生、發展中兩者可能具有協同作用。本組60例MM中c-myc蛋白與MDM2蛋白表達呈正相關，提示在MM的發生、發展中，c-myc和MDM2蛋白可能具有協同作用，兩者可共同促進腫瘤的發展。有關c-myc和MDM2基因共同作用于MM促進其發生、發展的分子機制尚不清楚，有待進一步實驗研究。

綜上所述，c-myc和MDM2蛋白表達與MM的發生、發展密切相關，聯合檢測c-myc和MDM2蛋白可能作為MM輔助診斷、判斷預后的依據，同時也可能成為臨床治療的有效靶點。

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Expression of c-myc and MDM2 protein in multiple myeloma and their clinical significance

ZHAO Zhi-hua, TIAN Yan, CHEN Kui-sheng

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Henan450052,China)

Purpose To investigate the expression of c-myc and MDM2 protein in multiple myeloma (MM) and their correlation with clinical stage. Methods Immunohistochemical SP three-step method was used to detect the expression of MDM2 and c-myc protein in 60 cases of MM with different clinical stages and 10 cases of nontumorous bone marrow tissue. Results The positive rate of c-myc protein in MM and nontumorous bone marrow tissue were 71.7% and 10.0%; the positive rate of MDM2 protein in two tissues were 80.0% and 20.0%, respectively. The expression difference of two proteins between MM and nontumorous bone marrow tissue was statistically significant (P<0.05). The expression of c-myc and MDM2 protein was positively correlated with MM clinical ISS stage (P<0.05), but irrelevant with the age and gender. The expression of c-myc and MDM2 protein in MM was positively correlated (P<0.05). Conclusion The c-myc and MDM2 protein have a highly expression in MM, and it may be relative to the occurrence of MM and clinical stage. In the MM, c-myc and MDM2 protein may have synergetic functions and promote the development of tumor.

bone neoplasms; multiple myeloma; c-myc protein; MDM2 protein; clinical stage

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.024.html

河南省高等學校重點科研項目(17A310036)

鄭州大學第一附屬醫院病理科，河南 450052

趙志華，男，碩士生導師，副教授。E-mail: 13598868878@163.com 陳奎生，男，碩士生導師，教授，通訊作者。E-mail: 15036607301@163.com

R 733.3

A

1001-7399(2017)02-0165-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.011

接受日期：2016-10-28