VE，IGF-I和hCG對(duì)體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

于宇翔，韓永利，李素娟，孫子龍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

VE，IGF-I和hCG對(duì)體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

于宇翔，韓永利，李素娟，孫子龍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

為了探究不同濃度維生素E（VE）、胰島素樣生長因子（IGF-I）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LCs）增殖的作用，試驗(yàn)通過添加不同濃度VE，IGF-I，hCG分別處理小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24，48 h，采用四唑鹽比色法（MTT法）檢測細(xì)胞活力。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，24 h時(shí)VE組細(xì)胞活力顯著增加（P＜0.05），IGF-I，hCG組差異不顯著（P＞0.05）；48 h時(shí)，VE，hCG組細(xì)胞活力差異顯著（P＜0.05），IGF-I組差異不顯著（P＞0.05）。說明在24，48 h的IGF-I對(duì)細(xì)胞的增殖變化沒有明顯促進(jìn)作用，VE和hCG對(duì)細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。

間質(zhì)細(xì)胞（LCs）；維生素E（VE）；胰島素樣生長因子（IGF-I）；人絨毛膜促性腺激素（hCG）；細(xì)胞增殖

近年來，調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌雄激素的各種因素越來越受到人們重視。睪丸間質(zhì)細(xì)胞分布于生精小管之間的疏松結(jié)締組織中，其主要功能是合成和分泌雄激素，它是一類含19個(gè)碳原子的類固醇激素,主要有睪酮、雄烯二酮等。雄激素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的作用具體表現(xiàn)在可以刺激雄性外生殖器官及內(nèi)生殖器官發(fā)育成熟，并維持其機(jī)能；促進(jìn)精子的發(fā)生及成熟；促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，特別是肌肉、骨骼以及生殖器官的蛋白質(zhì)合成，同時(shí)還能刺激細(xì)胞的生成。睪丸間質(zhì)細(xì)胞（LCs）的主要功能是合成和分泌睪酮，以調(diào)節(jié)生精作用、全身代謝以及雄性的第二性征[1]。有研究表明，體外培養(yǎng)的LCs可分泌高濃度的睪酮[2]。近年來，許多流行病學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)研究的資料表明，維生素E（VE）[3]、胰島素樣細(xì)胞生長因子-I（IGF-I）[4]、人絨毛膜促性腺激素（hCG）[5]能夠提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的增加。鑒于睪丸間質(zhì)細(xì)胞在生殖系統(tǒng)中的重要作用，本研究通過添加不同濃度的VE，IGF-I和hCG來探討對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，旨在為進(jìn)一步治療生殖系統(tǒng)方面的疾病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試動(dòng)物為3～4周齡昆明雄性小鼠，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基，F(xiàn)BS，0.25%胰蛋白酶，Gibco公司生產(chǎn)；青鏈霉素、維生素E，北京Solarbio公司生產(chǎn)；四唑鹽比色法（MTT法）試劑盒、吉姆薩試劑盒，Sangon公司生產(chǎn)；氟化鈉、hCG、尼克酰胺、脫氫表雄酮（DHEA），Sigma公司生產(chǎn)；硝酸藍(lán)四氮唑（NBT），Amresco公司生產(chǎn)；煙堿腺苷二核苷酸（NAD），Roche公司生產(chǎn)；IGF-I，武漢三鷹公司生產(chǎn)；其細(xì)胞培養(yǎng)用常規(guī)化學(xué)試劑，天津化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠采取頸椎脫臼處死，整個(gè)操作采取無菌處理，將小鼠睪丸去除表面的白膜，暴露出曲精細(xì)管，小心盡量不要破壞血管。用鑷子夾住去除了白膜的睪丸，用適量PBS進(jìn)行涮洗，由于間質(zhì)細(xì)胞疏松結(jié)合在曲精細(xì)管之間，在涮洗過程中會(huì)與睪丸分離。涮洗的過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)PBS變渾濁，然后將渾濁的PBS轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中進(jìn)行離心，1 200 r/min離心5 min，棄掉上清收集細(xì)胞。將細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM/F12。放入35～37℃的培養(yǎng)箱中，待其貼壁并換液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 3β-HSD染色 研究表明，3β-HSD只在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞存在[6-7]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞純度鑒定采用3β-HSD染色（尼克酰胺，DHEA，NBT，NAD）[8]，利用了其睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含有3β-HSD，而被特異性染成藍(lán)色的原理。將得到的細(xì)胞在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，加入染色液，通過3β-HSD染色后倒置顯微鏡下觀察呈藍(lán)黑色的細(xì)胞為間質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞純度達(dá)到90%以上可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.3 LCs吉姆薩染色 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行爬片，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行吉姆薩染色，去除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液反復(fù)漂洗細(xì)胞2次，每次5 min；加入PBS溶液，然后逐滴加入等體積甲醇，邊加邊慢慢混合，之后靜置10 min；棄去甲醇和PBS，加入新的甲醇液浸泡固定細(xì)胞10 min；棄去甲醇，加入2 mL吉姆薩染液，靜置15～20 min；去除染液，用超純水沖洗細(xì)胞，顯微鏡下觀察。

1.3.4 LCs活力測定 采用MTT法測定加入不同濃度VE，hCG，IGF-I后的細(xì)胞活力。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)加入96孔板，待其貼壁后加入不同濃度VE，h CG，IGF-I，依次培養(yǎng)24，48 h后，加入0.5 mg/mL MTT溶液10 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)37℃孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測定各孔吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，測定值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。差異顯著性利用one-way analysis of variance（ANOVA）分析，用Dunnett's多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCs純度鑒定及形態(tài)學(xué)觀察

間質(zhì)細(xì)胞是一種貼壁性能較好的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)2 d后貼壁性能良好（圖1-A）；3β-HSD染色后間質(zhì)細(xì)胞被特異性染成藍(lán)黑色細(xì)胞回縮變圓（圖1-B）；吉姆薩染色（圖1-C）可觀察到胞質(zhì)發(fā)生鋪展，伸出突起胞體呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，胞體較大，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，位于胞質(zhì)中央，染色顏色較淡，核仁1～2個(gè)，呈管嵴狀，一般有3～4個(gè)突起[9]。

2.2 不同濃度VE，IGF-I，hCG對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力的影響

24 h時(shí)，VE組（圖2-A）與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），IGF-I組（圖3-C）和hCG（圖4-E）與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。48 h時(shí)，VE組（圖2-B）與對(duì)照組相比，20，40 μg/mL差異顯著（P＜0.05），10 μg/mL差異極顯著（P＜0.01）；IGF-I組（圖3-D）差異不顯著；hCG組（圖4-F）與對(duì)照組相比，5，10 IU/mL差異顯著（P＜0.05），50，75，100 IU/mL差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

LCs是產(chǎn)生雄性激素的主要細(xì)胞，在體內(nèi)的分泌受下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的調(diào)節(jié)，其分泌睪酮主要是受黃體生成激素（LH）的調(diào)節(jié)。睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮是一系列酶促反應(yīng)，主要包括細(xì)胞色素P450家族（P450scc及P450c17）和羥基固醇脫氫酶（3β-HSD，17-HSD）[10]。而細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖，單細(xì)胞生物以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體，在生物體的整個(gè)系統(tǒng)代謝中也起到了十分重要的作用。

VE，又稱為生育酚，是一種非酶類抗氧化劑存在于細(xì)胞的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中[11]。VE具有很強(qiáng)的抗氧化性，所以，可當(dāng)作抗氧化劑使用也有助于阻止多元不飽和脂肪酸及磷脂質(zhì)被氧化，故可維持細(xì)胞膜的完整性[12]。IGF-I屬于胰島素類激素家族中的成員之一，對(duì)人和動(dòng)物的生長、發(fā)育和代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此，IGF-I也被稱作“促生長因子”，或者生長激素介質(zhì)。IGF-I是機(jī)體生長、發(fā)育和代謝的重要調(diào)控因子，同時(shí)也是動(dòng)物生長的直接調(diào)節(jié)物。研究表明，IGF-I能夠激活RNA聚合酶，調(diào)節(jié) RNA和DNA的合成，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化[13]。在其他的物種，有研究表明，IGF-I的增加可誘導(dǎo)睪酮分泌的增加[14]。hCG是妊娠期間由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，由2個(gè)不同的亞基α，β以非共價(jià)鍵連接組成，對(duì)雄性則具有促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分泌激素的作用，特別是睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)，使其產(chǎn)生雄激素，促使性器官發(fā)育及成熟，并促進(jìn)精子生成[15]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，VE，hCG在促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖方面都起到了一定的作用，VE對(duì)細(xì)胞增殖的作用最明顯。而且細(xì)胞增殖與處理時(shí)間的長短以及與添加物的濃度存在著一定的關(guān)系，但關(guān)于VE，IGF-I， hCG的添加如何誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的具體機(jī)制，以及細(xì)胞增殖與睪酮的產(chǎn)生有無直接聯(lián)系都有待進(jìn)一步研究探討。

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Effects of VE，IGF-I and hCG on Proliferation of Mice Leydig Cells in Vitro

YUYuxiang，HANYongli，LI Sujuan，SUNZilong

（College ofAnimal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To assess the promotive role of VE,IGF-I,hCG in leydig cells（LCs）proliferation,in this study the activity of LCs exposed to different concentrations of VE,IGF-I,hCG was detected by using MTT assay.The results showed that 24 h VEgroup administration significantly increased cell proliferation compared with control group（P＜0.05）,while IGF-I and hCG groups showed no significant effect.After 48 h,cell proliferation in VEand hCG groups increased significantly compared with control group（P＜0.05）. However,IGF-I group had no significant change.This study illustrated that IGF-I was not marked improve on cell proliferation at this time slot,VE,hCGhad certain promotion effect on cell proliferation.

leydig cells（LCs）;vitamin E（VE）;IGF-I;hCG;cell proliferation

S865.1

A

1002-2481（2017）03-0402-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.20

2016-12-27

山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計(jì)劃；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)青年拔尖創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（TYIT201408）

于宇翔（1988-），女，山東聊城人，在讀碩士，研究方向：環(huán)境獸醫(yī)學(xué)。孫子龍為通信作者。