Ⅰ期非小細胞肺癌淋巴結中ck19、肺特異性蛋白X mRNA表達與微轉移及預后的相關性研究

陸薇 梁克誠 吳漢剛 梁新梅 覃灝

Ⅰ期非小細胞肺癌淋巴結中ck19、肺特異性蛋白X mRNA表達與微轉移及預后的相關性研究

陸薇 梁克誠 吳漢剛 梁新梅 覃灝

目的 研究Ⅰ期非小細胞肺癌淋巴結中細胞角蛋白19(ck19)、肺特異性蛋白X(LUNX) mRNA表達與轉移及預后的相關性。方法 選擇68例我院胸外科術后經病理證實為Ⅰ期非小細胞肺癌患者(觀察組)和20例確診為肺炎性假瘤病例(對照組)，將入選病例腫瘤組織、肺門旁(N1)、縱隔淋巴結(N2)蠟塊，分別做HE染色和免疫組化檢測CK19、LUNX mRNA因子表達。結果 68例Ⅰ期非小細胞肺癌患者腫瘤組織均有CK19、LUNX mRNA表達，肺炎性假瘤病例患者淋巴結未見CK19、LUNX mRNA表達。22例淋巴結可見CK19表達，腺癌17例，鱗癌5例；ⅠA期8例，ⅠB期14例。15例淋巴結可見LUNX mRNA表達，腺癌11例，鱗癌4例；ⅠA期5例，ⅠB期10例。腺癌患者淋巴結CK19、LUNX mRNA表達顯著高于鱗癌患者，ⅠB期患者淋巴結CK19、LUNX mRNA表達顯著高于ⅠA期患者。鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N1淋巴結CK19、LUNX mRNA表達差異不明顯，鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N2淋巴結CK19、LUNX mRNA表達差異顯著(P<0.05)。僅N1淋巴結表達CK19、LUNX mRN患者的生存時間62.5個月，僅N2淋巴結表達CK19、LUNX mRN患者的生存40.2個月，N1和N2均表達CK19、LUNX mRN患者的生存時間36.6個月，NI和N2均為表達CK19、LUNX mRN患者的生存時間為64.8個月。僅NI表達患者與僅N2表達及N1+N2均表達患者的生存時間差異有統計學意義，與未表達患者的差異不顯著。僅N2表達患者的生存時間顯著低于未表達患者，與N1和N2均表達患者的生存時間差異不顯著。結論 CK19和LUNX mRNA可作為I期非小細胞肺癌患者淋巴結微轉移的標記物，腺癌患者和ⅠB期患者淋巴結微轉移率更高，N2淋巴結微轉移是患者影響I期非小細胞肺癌患者預后的主要原因，N2淋巴結微轉移患者的預后更差。

Ⅰ期非小細胞肺癌；ck19；特異性蛋白X mRNA；預后

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，也是我國城市人口惡性腫瘤死亡第一位原。雖然醫學對肺癌認識不斷深入，且臨床治療療效取得顯著進展，但是非小細胞肺癌(NSCLC)的生存率未明顯增加，完全切除術后Ⅰ期NSCLC復發率高達25%-50%[1]。既往研究報道患者常規檢查無法發現隱匿性微轉移是術后復發率高的主要原因，根據NSCLC微轉移判斷腫瘤轉移及原因對臨床治療和預后判斷具有重要意義[2]。CK19是臨床應用最廣的標記物，目前缺乏診斷肺癌淋巴結微轉移的轉移性標記物，且多數研究認為單一標記物診斷的敏感性不高，臨床需要根據多種標記物聯合診斷，提高臨床診斷的敏感性。LUNX是經nRNA差異顯示技術分離的一個人類肺組織特異性基因，僅在上腭、鼻咽器官等呼吸道表達，具有明顯的組織特異性。近年來部分研究報道LUNX mRNA作為檢測肺外微轉移指標的特異性和敏感度較高，可作為理想的檢測NSCLC微轉移分子標志物。本文以68例Ⅰ期NSCLC和20例肺炎假性腫瘤患者為研究對象，分析Ⅰ期NSCLC淋巴結中CK19和LUNX mRNA表達與微轉移及預后的關系，現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集2002年 1月1日-2008年 12月31收治的68例NSCLC患者患者，病理檢測符合國際抗癌聯盟(UICC)Ⅰ期診斷標準，ⅠA期35例，ⅠB期33例。入選標準：術前未行放化療，采用根治性切除術，性淋巴結清掃并留取肺門旁、縱隔淋巴結。患者男性46例，女22例，年齡搜集范圍18-65歲，平均(59.7±11.4)歲。病例類型：腺癌42例，鱗癌26例；同時選擇 20例確診為肺炎性假瘤病例為對照組，男性12例，女性8例。年齡18-64歲，平均(57.6±8.7)歲。

二、方法

將入選病例腫瘤組織、肺門旁(N1)、隆突下(N2)淋巴結蠟塊，重新切片4-6張，分別做HE染色和免疫組化檢測ck19、肺特異性蛋白X mRNA因子表達。具體操作：石蠟切片，脫蠟至水3% H2O2室溫孵育5-10 min。蒸餾水清晰后使用PBS浸泡5 min，加入適當比例稀釋一抗工作液，37 ℃孵育1-2 h或放置于4℃環境下過夜保存。使用PBS沖洗3次，2min/次。滴加二抗室溫或37℃孵育20-30 min，再次使用PBS沖洗3次，2min/次。顯色自來水沖洗、復染，脫水透明至封片。

術后當日開始隨訪，直至患者死亡或末次隨訪日。隨訪檢查內容包括胸部普通CT、增強CT掃描、頭顱CT及頭顱核磁共振掃描、腹部B超或CT平掃、腎上腺B超，必要時行全身放射性骨掃描、結合放射性濃聚部位骨核磁共振掃描，并根據Ⅰ期NSCLC診療指南給予局部或全身放化療等抗腫瘤綜合治療措施。術后1年內IA其患者定期接受隨訪和復查，未給予輔助放化療治療，ⅠB期患者接受放化療或免疫治療，未行放化療患者定期接受隨訪及復查。術后隨訪1年后，以電話、電子郵件方式隨。隨訪時間9個月-85個月，平均(37.5±28.6)個月，中位隨訪期3年。

三、統計學分析

使用SPSS21.0軟件處理，技術資料使用頻數和率(%)表示，兩組間比較使用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、CK19、LUNX mRNA表達

68例Ⅰ期NSCLC患者腫瘤組織均有CK19、LUNX mRNA表達，肺炎性假瘤病例患者淋巴結未見CK19、LUNX mRNA表達。22例淋巴結可見CK19表達，腺癌17例，鱗癌5例；ⅠA期8例，ⅠB期14例。15例淋巴結可見LUNX mRNA表達，腺癌11例，鱗癌4例；ⅠA期5例，ⅠB期10例。腺癌患者淋巴結CK19、LUNX mRNA表達顯著高于鱗癌患者，ⅠB期患者淋巴結CK19、LUNX mRNA表達顯著高于ⅠA期患者。(見表1)。

表1 淋巴結CK19、LUNX mRNA表達情況

注：a表示鱗癌與腺癌患者CK19表達差異顯著(t=2.574,P=0.024)；b表示鱗癌與腺癌患者LUNX mRNA表達差異顯著(t=3.541,P=0.037)；c表示ⅠB期與IA其患者CK19表達差異顯著(t=2.077,P=0.001)；d表示ⅠB期與ⅠA期患者LUNX mRNA表達差異顯著(t=2.569,P=0.002)

二、N1和N2淋巴結CK19、LUNX mRNA表達

鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N1淋巴結CK19、LUNX mRNA表達差異不明顯，鱗癌患者與腺癌患者、ⅠB期與ⅠA期患者的N2淋巴結CK19、LUNX mRNA表達差異顯著(P<0.05)。(見表2，3)。

表2 N1和N2淋巴結CK19表達比較

表3 N1和N2淋巴結LUNX mRNA表達比較

三、生存時間

僅N1淋巴結表達CK19、LUNX mRN患者的生存時間62.5個月，僅N2淋巴結表達CK19、LUNX mRN患者的生存40.2個月，N1和N2均表達CK19、LUNX mRN患者的生存時間36.6個月，NI和N2均為表達CK19、LUNX mRN患者的生存時間為64.8個月。僅NI表達患者與僅N2表達及N1+N2均表達患者的生存時間差異有統計學意義，與未表達患者的差異不顯著。僅N2表達患者的生存時間顯著低于未表達患者，與N1和N2均表達患者的生存時間差異不顯著。(見表4)。

表4 生存時間比較

討 論

微轉移是指非血液系統惡性腫瘤在發展過程中，癌細胞播散并存活于血液循環、淋巴道、骨髓或組織器官內，但未形成轉移結節，患者無臨床表現。現有研究發現[3]，肺癌淋巴結存在肺癌在無N1轉移情況下發生N2轉移，且跳躍轉移患者多為腺癌患者。但是肺癌淋巴結微轉移診斷缺乏統一性標記物，而標記物需要具備特異性強和敏感性高兩個特點，因而越來越多研究人員聯合多個標記物檢測肺癌微轉移，以提高檢測結果的敏感度[4]。本研究選擇CK19和LUNX mRNA作為標記物，結果顯示Ⅰ期NSCLC患者的肺癌組織均存在CK19和LUNX mRNA表達，未見假陰性及假陽性，表明CK19及LUNX mRNA的敏感性和特異性高。肺門及縱隔淋巴結檢查顯示CK19和LUNX mRNA的陽性率分別為16.2%、11.0%，符合既往研究報道的NSCLC淋巴結微轉移率[5]。ⅠB期患者的CK19和LUNX mRNA表達率顯著高于ⅠA期患者，表明IB和ⅠA期患者的淋巴結微轉移率存在明顯差異，ⅠB期淋巴結發生微轉移的幾率更高。在肺癌病例類型與淋巴結微轉移關系方面，現有研究未對兩者關系作出明確定論，部分研究報道肺癌類型與微轉移無明顯關系[6]，另一部分研究認為腺癌患者的微轉移率更高[7]。本研究中腺癌患者的CK19和LUNX mRNA表達率更高，且顯著高于腺癌(P<0.05)，提示CK19和LUNX mRNA表達情況可能用于判斷肺癌病例類型。

NSCLC治療及預后與腫瘤TNM分期關系密切，縱隔淋巴結是否存在轉移是判斷預后質量的重要標志。國外研究顯示[8]，肺癌患者可能存在N2淋巴結轉移，且多為侵襲性低分化腺癌患者，并且該研究認為N2淋巴結轉移可導致預后不良。國外相似研究也報道早期NSCLC患者存在N2淋巴結轉移患者的預后不佳，且發生復發和遠處轉移的幾率高[9]。本研究將患者分為N1和N2淋巴結兩組，結果顯示腺癌患者N2淋巴結CK19和LUNX mRNA表達率高于鱗癌患者，提示微轉移率更高；ⅠB期患者N2淋巴結表達CK19和LUNX mRNA表達率高于ⅠA期患者，提示ⅠB期患者N2淋巴結微轉移更高。

越來越多研究證實微轉移是預后不良的獨立危險因素，淋巴結微轉移是NSCLC患者預后不良的主要原因。國外研究報道腫瘤直徑低于2 cm的肺癌患者仍存在N2淋巴結轉移，N2轉移提示患者可能預后不良[10]。本研究對N1和N2淋巴結微轉移情況分析患者的生存時間，結果顯示N1和N2淋巴結未表達患者的生存時間最長，N1和N2表達CK19和LUNX mRNA患者的生存期最短，且生存時間與N1表達和N1+N2表達患者的生存時間差異顯著，僅N2表達患者的生存時間顯著低于僅N1表達患者，結果表明N2淋巴結微轉移患者的生存率更低，預后質量更差。但是N1+N2表達患者的生存時間雖然高于僅N2表達患者，但是差異不顯著，提示，Ⅰ期NSCLC患者N1淋巴結轉移對其生存率不影響。

綜上所述，CK19和LUNX mRNA可作為Ⅰ期NSCLC患者淋巴結微轉移的標記物，腺癌患者和ⅠB期患者淋巴結微轉移率更高，N2淋巴結微轉移是患者影響Ⅰ期NSCLC患者預后的主要原因，N2淋巴結微轉移患者的預后更差。

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Correlation of CK19, lung specific protein mRNA X expression with micro metastasis and prognosis in primary non small cell lung cancer

LUWei,LIANGKe-cheng,WUHan-gang,LIANGXin-mei,TAN

HaotheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiScienceandTechnologyUniversity,Liuzhou,Guangxi545000,China

Objective To study the correlation between the expression of cell keratin 19 (CK19), non specific protein X (LUNX) mRNA expression and prognosis in patients with stage I non-small cell lung cancer. Methods 68 cases after thoracic surgery pathologically confirmed as stage I non small cell lung cancer patients were selected as the observation group, and 20 cases diagnosed as inflammatory pseudotumor as the control group. Their tumor tissue and paraffin block near the door of pulmonary (N1) and mediastinal lymph (N2) were given HE staining and immunohistochemical detection to detect CK19 and LUNX mRNA expression. Results The expression of CK19 and LUNX mRNA was detected in tumor tissues of the observation group, but it wasn't detected in pulmonary inflammatory pseudotumor patients.CK19 expressed in 22 cases of lymph node, 17 cases of adenocarcinoma, 5 cases of squamous cell carcinoma, 8 cases at stage IA, and 14 cases at stage IB. LUNX mRNA expressed in 15 cases of lymph node, 11 cases of adenocarcinoma, 4 cases of squamous cell carcinoma, 5 cases at stage IA, and 10 cases at stage IB. The expression of CK19 and LUNX mRNA was significantly higher in lymph nodes of patients with adenocarcinoma than in patients with squamous cell carcinoma, and stage IB lymph node higher than stage IA. There was no significant difference in N1 lymph node of CK19 and LUNX mRNA expression between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients, stage IB and stage IA patients. There were significant differences in N1 lymph node of CK19 and LUNX mRNA expression between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients, stage IB and stage IA patients (P<0.05). The survival duration of only N1 lymph node expression of CK19 and LUNX mRNA was 62. 5 months, and 40.2 months for only N2 lymph node expression of CK19 and LUNX mRNA, and 36.6 months for N1 and N2 expressed CK19 and Lu Nx mRNA. The survival time of Ni and N2 expression of CK19 and LUNX mRNA was 64.8 months. Conclusion CK19 and LUNX mRNA can be as markers for stage I non small cell lung cancer micrometastasis in lymph nodes of patients, and patients with adenocarcinoma patients at stage IB have higher transfer rate. N2 lymph node micrometastasis is main reason for the prognosis of patients with small cell lung cancer (NSCLC) and N2 lymph node micrometastasis prognosis is worse.

stage I non-small cell lung cancer; CK19; specific protein X mRNA; prognosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.008

廣西壯族自治區衛生廳自籌經費科研課題基金(No Z2014580)

545000 廣西 柳州，廣西科技大學第一附屬醫院

2016-09-26]