HLA基因及其多態(tài)性與IVF—ET治療結(jié)局的研究進展

何培+李正偉+許益娟+張若鵬

摘要：在不孕癥患者中，行體外受精-胚胎移植治療后，機體對其的反應，在很大程度上取決于個體間基因組的差異。研究指出，人類白細胞抗原（HLA）多態(tài)性與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局有關，現(xiàn)此文就該研究領域的進展做了綜述。

關鍵詞：HLA基因；基因多態(tài)性；IVF-ET治療結(jié)局；進展

20世紀60年代后期，Robert G Edwards與Steptoe開始了人類體外受精的臨床研究[1]。他們首先采用激素刺激不孕癥女性患者的卵巢，然后腹腔鏡下獲取成熟卵母細胞并成功進行體外受精，繼續(xù)體外培養(yǎng)發(fā)育到8細胞胚胎，并嘗試將胚胎移植回該患者的子宮內(nèi)。經(jīng)過上百次失敗并克服諸多關鍵技術難題，最終于1978年7月25日，世界第一例“試管嬰兒”Louise Brown誕生，宣告人類體外受精技術取得成功。此后，體外受精技術在全世界蓬勃開展。體外受精-胚胎移植[2]（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）是指將不孕癥患者夫婦的卵子與精子取出體外，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中受精并發(fā)育成胚胎后，將胚胎移植入子宮腔內(nèi)以實現(xiàn)妊娠的技術。HLA即人類主要組織相容性復合體（MHC，major histocompatibility system），位于6號染色體短臂，長約4000 kb[3-5]。它由一系列緊密連鎖的基因座組成，是迄今為止所知的人類最復雜的遺傳系統(tǒng)，約占人類基因組的1/3000[6]。是人類基因組計劃完成并公布的人體中最復雜的免疫復合體，它具有種族、民族的特異性以及基因多態(tài)性，是人體在遺傳學方面重要的標志[7]。近些年來，模式生物基因組、微生物基因組以及人類基因組得到充分認識。

1 HLA基因分類

1.1 HLA I類區(qū)域 I類分子是由兩條多肽鏈組成，其中包括α微球蛋白和β2微球蛋白，α鏈有三個功能區(qū)，分別為α1、α2、α3，抗原多態(tài)性是由α1和α2功能區(qū)決定的，恒定區(qū)是α3功能區(qū)，經(jīng)典區(qū)HLA-A、B、C位點以及非經(jīng)典區(qū)HLA-E、F、G位點等都屬于HLA I類基因，它的產(chǎn)物表達在有核細胞的表面，其作用包括預防腫瘤、抵抗病毒以及在免疫系統(tǒng)中識別自我和非我。

1.2 HLAII類區(qū)域 α和β鏈組成的糖蛋白組成II類分子，經(jīng)典區(qū)HLA-DR、DQ、DP位點和非經(jīng)典區(qū)HLA-DN、DM、DO位點等組成了HLA II類基因，在巨噬細胞、B細胞及活化的T細胞表面分布，其產(chǎn)物主要參與與抗原的處理、加工和提呈。

1.3 HLAIII類區(qū)域 III類基因為補體區(qū)，位于HLA I類和HLA II類基因之間，編碼補體C2、C4A、C4B，備介素因子（Bf）和甾醇類21-羥化酶。

2 HLA-I類基因

2.1 HLA-A、B等位基因與高齡產(chǎn)婦 許多研究發(fā)現(xiàn)IVF-ET臨床結(jié)局與女性患者的年齡密切相關，因而以為年齡是影響臨床結(jié)局的重要因素之一。首先，隨著女性年齡增加， 其卵巢中儲備的卵母細胞數(shù)目逐漸減少[8]，卵基因巢儲備功能的下降導致即使應用了較大劑量的促性激素仍不能夠得到滿意數(shù)量的卵泡，因而就難以產(chǎn)生足夠的優(yōu)質(zhì)胚胎；其次，隨年齡增加，卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)的過氧化反應增強，導致氧自由基增加，可損傷到細胞核DNA 和線粒體DNA，致使能量供應物質(zhì)（ATP）減少，減數(shù)分裂受到不同程度的負面影響。如配子或胚胎發(fā)生了染色體異常和/或非整倍體，就會導致臨床妊娠率下降，自然流產(chǎn)率等不良妊娠結(jié)局增加。但近年來隨著老化免疫學的研究成為老化研究的熱點之一。老年人免疫指標的改變對揭示人類長壽的原因有重要的實際意義，對于“長壽老年人”的免疫學機制，以及免疫指標與HLA等位基因的相關性還有待于深入的研究，并結(jié)合不同年齡段人群的相關指標做免疫動態(tài)研究。HLA是復雜的人類多態(tài)性遺傳系統(tǒng)，因人種、地域及研究角度的不同而存在很大的差異。有研究[9]發(fā)現(xiàn)HLA-A、B等位基因與人類的壽命有關聯(lián)，可以認為HLA-A29和HLA-B13可能是人類長壽的有利基因，而HLA-B61可能是人類長壽的不利基因。這一研究的突破，將可能會使高齡對不良孕產(chǎn)婦行IVF-ET的治療，產(chǎn)生一個新的突破口。以期提高“試管嬰兒”的活嬰分娩率。

2.2 HLAI類基因多態(tài)性與免疫排斥反應 免疫學研究以為，同種性質(zhì)的物質(zhì)移植的現(xiàn)象是妊娠，異種移植的排斥的結(jié)果是流產(chǎn)[10]。在臨床妊娠過程中，胚胎是一種半同體抗原但不受母體排斥而存在，這和蛻膜組織中有正常的免疫微環(huán)境有關。胚胎源性抗原與母體的免疫系統(tǒng)形成免疫平衡狀態(tài)，這是胚胎得以存活的前提條件，一旦這種平衡被打破，導致母體與胚胎免疫失衡，將可能造成反復胚胎種植失敗或流產(chǎn)的發(fā)生，在胚胎種植過程中免疫學調(diào)控發(fā)揮重要的角色[11]。有研究報道，人成纖維細胞被HLA-A2的反義核酸技術處理后再被移植入帕金森病大鼠紋狀體，異種移植排斥反應程度可降低以及細胞的存活時間延長[12-14]。劉建生等人[15]根據(jù)這個原理，設計篩選出2個相對效果較好的小干擾 RNA片段，隨機選擇1個并將有效的序列克隆入慢病毒載體并進行包裝后， HLA-A2在 293T細胞中的表達能有效地沉默。可在實驗中獲得的siRNA-HLA-A2能有效沉默人胚肺中HLA-A2基因的表達，減弱或抑制感染了siRNA-HLA-A2的人胚肺成纖維細胞HLA-A2抗原的數(shù)量，從而達到減弱細胞的免疫有排斥反應的發(fā)生。該實驗給了我們生殖醫(yī)學人員新的啟發(fā)，研究HLA某種基因有效沉默IVF-ET胚胎著床時的免疫排斥反應，從而有效提高胚胎著床率，進一步提高子宮容受性，為提升IVF-ET臨床妊娠率找到了一個新的方向。

3 HLA基因多態(tài)性與流產(chǎn)

部分不良孕產(chǎn)婦行IVF-ET治療后，臨床妊娠后仍有些不明原因流產(chǎn)。研究表明，流產(chǎn)（abortion）是指妊娠不足28w、胎兒體重不足1000 g而終止者。是臨床常見的妊娠并發(fā)癥，約1%～3%的夫婦經(jīng)歷過流產(chǎn)。流產(chǎn)在婦產(chǎn)科疾病常見，妊娠婦女的身體健康受到極大傷害。但是目前仍有部分妊娠婦女流產(chǎn)原因不明。

過去針對流產(chǎn)與HLA的相關研究很多，但是針對不同人種，會產(chǎn)生不同的研究結(jié)果，有一項針對印度人的調(diào)查顯示，HLA-G*010105和HLA-G*010108兩個等位基因在正常生育的婦女中檢測不出來，但是這兩個基因在反復流產(chǎn)婦女中卻可以檢測其出現(xiàn)的頻率，而且在正常生育的婦女中HLA-G010103的頻率明顯低于反復流產(chǎn)患者[16]。結(jié)果顯示，反復妊娠丟失與HLA-G的多態(tài)性有關[17]。另一項在波蘭人的研究中，在正常生育婦女和反復流產(chǎn)患者中12個HLA-G等位基因頻率無太大的差異[18]。或許是人種和地區(qū)的差異造成了這一現(xiàn)象。某項研究認為[19]，人類白細胞抗原DQBI*0303單元型可能與RSA發(fā)病密切相關，但是對于DQBI*0303單元型如何引起RSA的作用機制應該進一步研究，以便明確其在RSA發(fā)生中的具體作用。研究表明[20]HLA區(qū)域中TNF等位基因以及它與TNF水平的關系與不明原因習慣性流產(chǎn)有關，并根據(jù)對比研究，結(jié)論表明：TNF-B G252A 基因多態(tài)性與不明原因流產(chǎn)相關。如何改變、抑制或敲出TNF-B G252A 基因多態(tài)性，改善不明原因流產(chǎn)的妊娠結(jié)局，將是我們生殖醫(yī)學醫(yī)務工作者另一個研究方向。

4 HLA基因多態(tài)性與妊娠

最新外文研究報道[21]：在行IVF-ET移植后，將患者分為妊娠失敗組和成功組，利用高通量基因表達譜測序比較兩者在3個不同階段（IVF-ET-I期、卵巢刺激-II期、胚胎移植后15 d階段-III期）的差異表達基因并進行分析，結(jié)果顯示 基于KEGG富集通路分析，選擇主要組織相容性復合體-A（HLA-A）、 白介素-1β（IL-1β）、主要組織相容性復合體-DQA1（HLA-DQA1）、血紅蛋白D（HBD）、微小染色體維持缺陷蛋白4（MCM4）等5個基因?qū)θ焉锝Y(jié)局影響最為重要。并且顯示在妊娠失敗組中，階段II中，HLA-A表達降低，而在階段III中表達急劇升高；而在妊娠成功組中，妊娠期間HLA-A表達逐漸降低，遠低于妊娠失敗組。妊娠失敗組中， HLA-DQA1在妊娠持續(xù)期間表達增加；而在妊娠成功組中，表達持續(xù)降低，但表達量始終高于妊娠失敗組。妊娠失敗組中，IL-1β在妊娠持續(xù)期間表達增加；研究顯示HLA-A和 HLA-DQA1與妊娠發(fā)育、持續(xù)密切相關，提示HLA-A和 HLA-DQA1也可作為妊娠預測的分子標記物。并為IVF-ET反復妊娠失敗的患者提供了靶向治療的可能。

另外還有報道指出[22]，在進化過程中，HLA的多態(tài)性越來越豐富，單倍型數(shù)目也逐步增加。研究 HLA單倍型與疾病的關系，可以得到比研究單個HLA位點等位基因與疾病的相關性更多的信息。這將會對于不良孕產(chǎn)婦行IVF-ET治療提供新的方向。

參考文獻：

[1]黃國寧.輔助生殖實驗室技術[M].1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014： 73.

[2]中華醫(yī)學會.臨床診療指南·與精子庫分冊輔助生殖技術[M].1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：64.

[3]Bmnson PG，Mack SJ，Edich HA，et a1.A sequence-based approach demonstrates that balancing selection in classical human leukocyte antigen（HLA）loci is asymmetric[J].Hum Mol Genet，2013，15，22（2）：252-261.

[4]Hussain N，Jaffery G.Distribution of human leukocyte antigen alleles in systemic lupus erythematosus patients with angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism[J].Bosn J Basic Med Sci，2013，13（1）：57-62.

[5]Saba I，Maszocco G，Plewczynski D.Erratum to：Consensus classiflcation of human leukocyte antigen class II proteins[J].Immunogeneties，2013，65（4）：313.

[6]何淼，康冰.河南地區(qū)漢族人群原因不明復發(fā)性流產(chǎn)[J].中華醫(yī)學遺傳雜志，2014，31（04）：504-507.

[7]曾明星.HLA-A、B、DRB高分辨等位基因與IgA腎病所致慢性腎功能衰竭的關聯(lián)性研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2015.

[8]李萍，丁露.影響IVF-ET妊娠結(jié)局的相關因素分析[J].中國婦幼保健，2013，28（14）：2246-2248.

[9]王卓.HLA-A、B等位基因多態(tài)性與"長壽年齡"的關聯(lián)及其可能的免疫學機制[D].大連：大連醫(yī)科大學，2005.

[10]Schoolcraft WB，surrey ES，Minjare DA，et al.Management of poor reaponders； can outcomes be improved with a novel gonndotropin relasing. hormone antagonist letrozole protocol[J].FetrilSteril，2008，89（1）： 151-156.

[11]Makrigiannakis A，Petsas G，Toth B，et al.Recent advances in understanding immunology of reproduetive failure[J].Reprod Immunol，2011， 90：96-104.

[12]段德義，張海燕，徐群淵，等.反義HLA A2和GDNF共表達逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構建和鑒定[J].神經(jīng)解剖學雜志，2005，21（2）：103-107.

[13]Sawada Y，Komori H，Tsunoda Y，et al.Identification ofHLA-A2 or HLA-A24-restricted CTL epitopes for potential HSP105-targeted immunotherapy in colorectal cancer[J].Oncol Rep，2014，31（3）：1051-1058.

[14]李穎，楊慧，徐群淵，等.反義HLA A2 cDNA抑制人成纖維細胞于大鼠腦內(nèi)移植后的免疫排斥反應[J].神經(jīng)解剖學雜志，2005，21（2）：113-118.

[15]劉建生，趙剛.HLA-A2小干擾RNA的設計及沉默效果檢測[J].中國組織工程研究，2014，18（29）：4605-4610.

[16]AbbasA，Tripathi P，Naik S，et al.Analysis of human leukocyte antigen（HLA）G polymorphism in normal women and in women with recurrent spontaneous aboaions[J].Eur J Immunogenet，2004，31（6）：275-278.

[17]魯平，張愛愛，于峰，等.習慣性流產(chǎn)與抗心磷脂抗體檢測的相關性分析[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2011，45（16）：606-607.

[18]Sipak SO，Cybulski C，Lubinski J，et al.HLA-G polymorphism in a Polish population and reproductive failure[J].Tissue Antigens，2008，71（1）：67-71.

[19]楊旭，阿米娜，王琳.習慣性流產(chǎn)與人類白細胞抗原DQB1基因多態(tài)性的相關性[J].臨床研究，2013，20（19）：51-52.

[20]周蕓.腫瘤壞死因子及其基因多態(tài)性與不明原因習慣性流產(chǎn)的關系的研究[D].廣州：廣州醫(yī)學院，2006.

[21]Zhang R，Yu C，Wu R，et al.RNA-Seq-Based Transcriptome Analysis of Changes in Gene Expression Linked to Human Pregnancy Outcome After in Vitro Fertilization-Embryo Transfer[J].Reprod Sci，2016，23（1）：134-145

[22]陳麗娜.1626個中國家系的HLA單倍型分析及新等位基因的鑒定[D].福州：福建醫(yī)科大學，2014，4.

編輯/成森