酶解牦牛骨粉骨髓粉對大鼠骨密度影響的研究

肖帆+徐薔+李華迪

摘要：目的 研究酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、牦牛骨粉骨髓粉混合物、碳酸鈣的補鈣效果。方法 實驗采用60只體重（65±5）g的SPF級4周齡雌性SD大鼠，分為6組每組10只，即原始飼料組、酶解骨粉骨髓粉組（低、中、高三組）、牦牛骨粉骨髓粉組、碳酸鈣組，投喂含有相應補鈣產(chǎn)品的飼料，喂養(yǎng)14 w。每周測一次體重，喂養(yǎng)3 w后進行鈣代謝實驗，喂養(yǎng)14 w后處死取出左側(cè)股骨，測量骨長、干重、骨鈣以及骨密度等指標。結(jié)果 酶解骨粉骨髓粉、牦牛骨粉骨髓粉、碳酸鈣以及原始飼料組的大鼠喂養(yǎng)14 w后的體重、股骨長度無明顯差異（P>0.05）；酶解骨粉骨髓粉、牦牛骨粉骨髓粉、碳酸鈣組的鈣表現(xiàn)吸收率低于原始飼料組鈣表現(xiàn)吸收率（P<0.05），但是酶解骨粉骨髓粉組鈣表現(xiàn)吸收率高于同劑量組的牦牛骨粉骨髓粉組及碳酸鈣組（P<0.05）；三種鈣劑組的大鼠骨密度均高于原始飼料組（P<0.01），酶解骨粉骨髓粉組的大鼠骨密度高于碳酸鈣組以及牦牛骨原粉組的大鼠骨密度（P<0.05）；10倍、30倍酶解骨粉骨髓粉組的骨干重高于原始飼料組以及同劑量的其他鈣劑組（P<0.01），其余各組鈣劑的骨干重均無明顯差異；10倍、30倍的鈣劑組的大鼠骨鈣含量高于原始飼料組大鼠骨鈣含量（P<0.05）且酶解骨粉骨髓粉組（P<0.01），同劑量的酶解骨粉骨髓粉組的大鼠骨鈣含量高于同劑量的其他兩組的骨鈣含量（P<0.01）。結(jié)論 與牦牛骨原粉以及碳酸鈣相比，酶解骨粉骨髓粉不僅能提高鈣表現(xiàn)吸收率，而且還能顯著增加骨密度以及骨鈣含量，是一種優(yōu)秀的鈣補充劑。

關鍵詞：牦牛骨粉；牦牛骨髓粉；多肽螯合鈣；骨密度；鈣表現(xiàn)吸收率；酶解

Abstract：Objective To study the enzymatic hydrolysis of yak bone marrow powder mixture，mixture of yak bone marrow powder，calcium carbonate， calcium effect.Methods Using 60 weight（65±5） g SPF level 4-week-old female SD rats，divided into 6 sets of 10，the original group，enzymatic bone bone marrow Group（a group of low，medium，and high），yak bone bone marrow，calcium carbonate groups，fed with feed containing calcium products， feeding 14 w.Measured weight per week，feeding calcium metabolism experiments after 3 w，feeding 14 w after death removed the left femur，measure bone length，dry weight，calcium，and bone density，and so on. Results Enzymatic hydrolysis，yak bone marrow bone marrow powder powder，calcium carbonate，as well as the original feed rats after feeding 14 w weight，no significant difference in the length of the femur （P>0.05），enzymatic hydrolysis， yak bone marrow bone marrow powder powder，Calcium carbonate group of calcium performance absorption rate below original feed group calcium performance absorption rate（P<0.05），but enzyme solutions bone meal bone marrow powder group calcium performance absorption rate above with dose group of yak bone meal bone marrow powder group and the calcium carbonate Group（P<0.05）； three species calcium Agent Group of big rat bone density are above original feed group（P<0.01），enzyme solutions bone meal bone marrow powder group of big rat bone density above calcium carbonate group and yak bone original powder group of big rat bone density（P<0.05）；10 times times，and 30 times times enzyme solutions bone meal bone marrow powder group of backbone heavy above original feed group and with dose of other calcium Agent Group（P<0.01）， remaining the Group calcium agent of backbone heavy are no obviously differences；10 times，and 30 times of calcium Agent Group of big rat bone calcium content above original feed group big rat bone calcium content （P<0.05） and enzyme solutions bone meal bone marrow powder group （P<0.01），with dose of enzyme solutions bone meal bone marrow powder group of big rat bone calcium content above with dose of other two group of bone calcium content （P<0.01）.Conclusion Comparing with yak bone powder，calcium carbonate，enzymatic bone bone marrow can enhance calcium absorption，but also significantly increased bone mineral density and bone calcium content， calcium is an excellent supplement.

Key words：Yak bone powder；Yak bone powder；Polypeptide chelated calcium；Bone mineral density；Calcium absorption performance；Enzymatic hydrolysis

根據(jù)2015年“中國民營養(yǎng)與慢性病狀況報告”調(diào)查結(jié)果顯示，我國人民膳食營養(yǎng)攝入量中鈣的攝入量依舊不足，鈣缺乏尤為明顯[1-2]。因此尋找來源豐富、質(zhì)優(yōu)價廉、吸收率高的補鈣產(chǎn)品，對于預防缺鈣和骨質(zhì)疏松具有十分重要的意義。骨骼中的鈣主要以難溶的羥基磷酸鈣存在，采用簡單的物理方法制得的補鈣產(chǎn)品不利于人體吸收利用。而通過生物酶工程促使骨骼中的鈣轉(zhuǎn)化為游離鈣離子，并與多肽螯合生成多肽螯合鈣，能較好的促進機體對鈣的利用。因此，開發(fā)利于人體吸收的新型補鈣制劑，對于改善中國人群鈣缺乏具有重要的意義。本實驗以SPF級4 w齡雌性SD大鼠為模型，通過比較酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、牦牛骨粉骨髓粉混合物、碳酸鈣對大鼠體重、骨鈣、骨密度及鈣表現(xiàn)吸收率的影響。為此類產(chǎn)品在人體內(nèi)吸收利用的效果研究提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1鈣劑 酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、牦牛骨粉骨髓粉混合物、碳酸鈣，其中牦牛骨粉、牦牛骨髓粉由青海雪牛生物提供，酶解牦牛骨粉骨髓粉利用牦牛骨原粉、骨髓粉使用酶解工藝由實驗室通過雙酶酶解后制得，碳酸鈣由上海諾成藥業(yè)提供，中性蛋白酶（40萬U/g）、木瓜蛋白酶（80萬U/g）由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供，并檢測每100 g樣品中鈣的含量[3]，含鈣量分別為酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物中含鈣量為27.7%，牦牛骨原粉含鈣量為25.0%，碳酸鈣含鈣量為40.0%。

1.1.2試驗動物 實驗采用60只體重（65±5）g的SPF級4周齡雌性SD大鼠，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境，實驗環(huán)境溫度23～24℃，濕度55%～58%。

1.1.3動物飼料 動物基礎飼料配方為酪蛋白10.0%、黃豆粉15.0%、小麥面粉53%、花生油4.0%、2.3%纖維素、3.3%混合礦物質(zhì)、1.0%混合維生素、0.2%氯化膽堿、0.2%DL-蛋氨酸、11.0%淀粉。調(diào)整鈣含量為100 mg/100 g飼料。用此飼料配方配置鈣劑組，可根據(jù)鈣劑的需要量調(diào)節(jié)淀粉用量。上述動物飼料由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。飼料在加工、運輸、儲存過程中應嚴防污染、發(fā)霉、變質(zhì)，飼料在稱量過程中應嚴防人為的飼料灑落。

1.1.4主要儀器設備 雙能X線吸收骨密度儀（DEXA，Hologic Delphi A），原子吸收分光光度計（HG 9620A 型）。

1.2試驗方法

1.2.1酶解骨粉骨髓粉的制備[4-6] ①牦牛骨粉和牦牛骨髓粉以4∶1的比例混合，添加混合物總質(zhì)量的8倍純水，混合攪拌均勻，加熱至40℃，調(diào)節(jié)pH值至7.0加入中性蛋白酶反應30 min；②調(diào)節(jié)pH至5.0，調(diào)節(jié)溫度為60℃，加入木瓜蛋白酶反應1 h；③調(diào)節(jié)pH至7.0，調(diào)節(jié)溫度為65℃，繼續(xù)反應2 h后收集混合物，干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2動物分組以及鈣劑劑量設置 大鼠經(jīng)過適應性喂養(yǎng)1 w后，按體重隨機分為6組，每組10只，分為原始飼料對照組A，酶解牦牛骨粉骨髓粉組B1、B2、B3，牦牛骨粉骨髓粉組C，以及碳酸鈣組D。其中除了原始飼料對照組外，其余各組都是在原始飼料組的基礎上以摻入的方式將鈣劑添加到原始飼料中。人體推薦鈣攝入量為1000 mg/d[7-9]，按照體重60 kg計算，得16.7 mg/kg，設置5、10、30倍人體推薦量的低、中、高鈣劑組對應B1、B2、B3，C組為人體推薦量的10倍，D組也為人體推薦量的10倍。A組調(diào)節(jié)鈣含量為100 mg/100 g，其余5組理論鈣含量為B1 183.5 mg/100 g，B2 267 mg/100 g、B3 601 mg/100 g，C 267 mg/100 g，D 267 mg/100 g，實際測得5組鈣含量為B1 156 mg/100 g，B2 238 mg/100 g，B3 585 mg/100 g，C 241 mg/100 g，D 235 mg/100 g。

1.2.3飼養(yǎng)方法 按大鼠攝食量10%計，分別將鈣劑摻入飼料中，大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由攝食，飲用去離子水，以避免從水中獲得鈣，飼養(yǎng)14 w。

1.2.4觀察指標 ①體重：實驗期間每周稱體重1次。②代謝實驗：實驗3 w后將動物放在代謝籠中進行3 d鈣代謝實驗。記錄3 d進食量，收集72 h糞便，測定糞便、飼料中鈣含量，利用原子吸收法測定。繼續(xù)飼養(yǎng)至14 w。鈣表現(xiàn)吸收率=（攝入鈣-糞鈣）/攝入鈣×100%。③骨密度測定：以雙能X線吸收骨密度儀（DEXA）測定股骨中點、遠心端（BMD）。將待測骨放置于測量臺上與骨密度儀測頭移動方向垂直；移動待測骨，令其待測點標記線與探測頭移動軌跡于測量臺上的垂直投影重合。開始測量，每點測定5次，5次結(jié)果中若有兩組結(jié)果不平行（誤差<10%），則重新測定。取平均值，以骨寬（BW）除骨礦物質(zhì)含量（BMC），其結(jié)果即為骨密度（BMD）。④股骨長度，干重：剝離兩側(cè)股骨，剔除肌肉和筋膜，取左側(cè)股骨105℃烘箱烘干至恒重，游標卡尺量骨長，稱重。⑤骨鈣測定：取烘干至恒重的左側(cè)股骨、經(jīng)混和酸（硝酸∶高氯酸=4∶1）濕消化后，以0.5%的氧化鑭溶液定容，采用原子吸收分光光度計（HG9620A型）測定其含鈣量。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS軟件進行單因素方差分析和LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1對大鼠體重的影響 見表1。實驗初始期間各組大鼠體重無明顯差異。實驗期間，各組大鼠的體重都有不同程度的增長。實驗結(jié)束時，鈣劑組大鼠體重明顯高于原始飼料組大鼠體重，但鈣劑組各組之間無明顯差異。

2.2對大鼠鈣表現(xiàn)吸收率的影響 見表2。實驗各組鈣的表現(xiàn)吸收率均明顯低于原始飼料組（P<0.05），這與機體缺乏鈣時吸收率增加有關。酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物的鈣表現(xiàn)吸收率比同劑量的其他鈣劑組有顯著增加。牦牛骨粉組和同劑量的碳酸鈣組無明顯差異（P<0.05）。由此可以證明，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物具有增加大鼠鈣表現(xiàn)吸收率的作用。

2.3對大鼠股骨骨密度的影響 見表3。鈣劑組大鼠骨密度與原始飼料組大鼠骨密度有極顯著差異（P<0.05），同時同劑量酶解牦牛骨粉骨髓粉組與碳酸鈣組、純牦牛骨粉組有顯著差異（P<0.05）。以上結(jié)果可以得出，酶解牦牛骨粉骨髓粉組對大鼠骨密度的提高具有很大作用。

2.4對大鼠股骨長度、干重的影響 見表4。不同鈣劑對大鼠的骨長度均無顯著性差異（P>0.05），A組、B1組、C組、D組的骨干重無顯著性差異（P>0.05），B2、B3組即10倍以及30倍酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物組的骨干重高于原始飼料組A，牦牛骨粉骨髓粉組以及碳酸鈣組，有極顯著差異（P<0.01）。以上結(jié)果表明，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物具有增加大鼠骨干重的作用。

2.5對大鼠骨鈣的影響 見表5。鈣劑組均比原始飼料組A有顯著差異（P<0.05），且酶解牦牛骨粉骨髓粉組有極顯著差異（P<0.01）。酶解牦牛骨粉骨髓粉組與同劑量牦牛骨原粉組有極顯著差異（P<0.01），與同劑量碳酸鈣組同樣有極顯著差異（P<0.01）。碳酸鈣組與同劑量牦牛骨原粉組無顯著差異。由此可以表明，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物對大鼠股骨骨鈣含量的增加有極大的作用。

3 討論

牦牛骨粉含有豐富的營養(yǎng)素，除含鈣20%～30%、磷8%～14%外，還含有豐富的微量元素，蛋白質(zhì)含量35.7%，占總量26.694%的18種氨基酸中，必須氨基酸占總量的5.518%，骨粉中鈣的存在形式有利于動物吸收，因為骨粉中的鈣主要以羥基磷灰石結(jié)晶形式存在，該結(jié)晶與膠原纖維結(jié)合在一起，骨粉中膠原纖維酶解后，羥基磷灰石結(jié)晶就部分解離，進而轉(zhuǎn)化為水溶性氨基酸鈣，這種物質(zhì)極易被動物吸收[10-11]。牦牛骨髓含有豐富的蛋白質(zhì)、Ca、P、Fe、Zn、Cu，以及軟骨素、卵磷脂、多種維生素等營養(yǎng)成分，營養(yǎng)價值極高。牦牛骨髓中還含有多種氨基酸，包括人體內(nèi)不能合成的必需氨基酸，具有補充機體營養(yǎng)成份和提高免疫力的作用，特別是其中含有人腦中不可缺少的磷脂質(zhì)、磷蛋白與防止人體老化的骨膠朊和軟骨素，而且鈣磷比例合理，易于人體的消化吸收[12-13]。通過酶解骨粉以及骨髓粉混合物，使鈣與多肽作用螯合生成多肽螯合鈣，促進鈣的利用[14-15]。本實驗選取了酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、純牦牛骨粉，以同劑量碳酸鈣為對照，觀察其對大鼠的補鈣影響。為酶解牦牛骨粉骨髓粉在人體內(nèi)的吸收利用的效果研究提供一定的實驗依據(jù)。

從本實驗結(jié)果可以看出，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物與碳酸鈣、純骨粉相比，不僅能提高鈣表現(xiàn)吸收率，而且還顯著增加骨密度以及骨鈣含量。這可能與酶解牦牛骨粉骨髓粉后產(chǎn)生的多肽鈣、適當?shù)拟}磷比等有關。綜上所述，本實驗可以初步判定酶解牦牛骨粉骨髓粉可以作為一種效果上佳的鈣源，是作為鈣補充劑的較好選擇。

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編輯/楊倩