骨碎補醇提物對維甲酸致小鼠骨質疏松模型的影響

趙興亞+錢海兵

摘要：目的 研究骨碎補醇提物對用維甲酸誘導的小鼠骨質疏松模型的影響。方法 采用維甲酸灌胃造成小鼠實驗性骨質疏松癥模型，同時灌胃低、中、高3種計量的骨碎補醇提物，14 d后測定血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶的活性（TRAP）的活性，以及血清中骨鈣素（BGP）和雌二醇（E2）的含量。結果 維甲酸可引起小鼠骨質疏松，骨碎補醇提物可升高E2的數值，同時降低堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨鈣素的水平。結論 骨碎補醇提物對于維甲酸造成的骨質疏松癥模型有一定的預防作用。

關鍵詞：骨碎補醇提物；維甲酸；骨質疏松；小鼠

骨質疏松癥（OP）是一種以骨量減少、骨組織微結構異常為特征，致使骨骼脆性增加、極易發生骨折的一種全身性代謝性骨骼系統疾病[1]，隨著人口老齡化的持續發展，骨質疏松的發病率目前在常見疾病和多發病中居于第七位，已經嚴重影響中老年人群的健康生活，臨床上西藥治療骨質疏松的藥物并不多，且大多治療靶點過于單一，毒副作用較強[2]。我國是中藥大國，擁有豐富的中草藥資源，且中藥治療骨質疏松也已有上千年歷史，中藥具有療效明顯、價格低廉、毒副作用小等優點，必定會成為研究防治骨質疏松癥的新渠道和新方向。

骨碎補為水龍骨科多年生蕨類植物槲蕨 Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根莖，其性溫、味苦具有補腎活血、止血續傷等功效，為骨科常用藥[3]。近代的藥理學研究也表明骨碎補具有補肝腎、強筋骨的作用[4]。同時也發現骨碎補醇提物可促進成骨細胞的增殖、分化以及礦化[5-6]，從而起到防治骨質疏松的作用。目前，單純研究骨碎補醇提物對骨質疏松癥影響的研究較少。本實驗觀察不同劑量骨碎補醇提物對維甲酸致骨質疏松小鼠的影響，從而探尋其可能產生的影響。

1 材料與方法

1.1動物 昆明種小鼠6～8 周齡，體重（25±5） g，雌雄各半，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012-0001。

1.2藥物及試劑 骨碎補藥材及其提取液制備：骨碎補購自北京同仁堂（貴陽藥店），經貴陽中醫學院王祥培副教授鑒定。取骨碎補藥材粉末3 kg，12倍量75%乙醇回流提取3次，濾過合并濾液，減壓回收至干，通過預實驗加 0.5% CMC-Na 配成所需濃度（30、60、120 mg/kg）的灌胃劑（HPLC測得柚皮苷質量分數為0.74%），制備完畢后置4℃保存備用[7]。全反式維甲酸（retinoicacid，RA，山東良福制藥有限公司，純度為101.4%）；維生素D3注射液（VD3，上海通用藥業股份有限公司）；鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；骨鈣素（BGP）、雌二醇（E2）放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所。

1.3儀器 BT815A型半自動生化分析儀（上海三科儀器有限公司）；SN 695型放射免疫計數器（上海日環儀器廠）。

1.4分組及造模 將60只小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，分別為空白組、模型組、骨碎補醇提物低、中、高劑量組及陽性藥VD 3組。所有實驗動物飼養條件一致，適應性飼養1 w后，于每日上午空白組灌純凈水外，其余各組小鼠均灌胃給予RA 90 mg/kg，連續14 d。在造模的同時，VD 3組及骨碎補醇提物各劑量組每天下午給予不同濃度的受試藥。各組給藥容積均為0.02 ml/g，給藥期間隔天稱量體重以調整給藥量。停藥次日，小鼠摘眼球取血。

1.5檢測指標 血清生化及相關激素指標：血清鈣、磷、ALP、TRAP檢測步驟均按照試劑說明書進行。血清BGP、E2含量用放射免疫法測定。

1.6統計學處理 各項參數均表示為（x±s），采用SPSS13.0統計軟件進行分析，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1對血液生化指標的影響 同空白組比較，模型組血鈣水平下降，用藥后血鈣水平可見升高，但與模型組比較無顯著性差異；模型組s-P，s-ALP，s-TRAP顯著升高（P<0.05），骨碎補醇提物的中劑量和高劑量組與模型組相比顯著降低（P<0.05，P<0.01），見表1。

2.2對骨代謝相關激素水平的影響 模型組小鼠s-BGP水平明顯高于空白組（P<0.05），而VD3組及骨碎補醇提物各劑量組能降低s-BGP水平，但與模型組比較無統計學差異。與空白組比較，模型組s-E2水平下降，骨碎補醇提物各劑量組使體內s-E2水平上升，特別是骨碎補醇提物的高劑量組升高明顯（P<0.05），見表2。

3 討論

骨代謝和骨轉換的過程是成骨細胞形成新骨和破骨細胞吸收舊骨的過程。原發性骨質疏松癥正是由于骨重建單位中骨形成與骨吸收這一平衡被破壞而產生的[8]。用維甲酸誘導所致的小鼠骨質疏松模型在發病的癥狀以及對雌激素的骨反應上都與人類有較好的相似性，是研究骨質疏松癥的一個較好的造模方法[9]。VD3被公認為目前預防及治療骨質疏松癥的一線藥物。在本次實驗中可以看到VD3并不能顯著提高小鼠體內雌激素水平，說明其防治骨質疏松的作用機制可能與激素無關。本實驗模型組小鼠s-ALP及s-TRAP水平均明顯升高，這表明維甲酸既可以促進成骨細胞的增殖和分化，又可以增加破骨細胞的骨吸收，造成高轉化型骨質疏松癥。應用骨碎補醇提物，特別是骨碎補醇提物高劑量組可顯著降低小鼠血清ALP及TRAP含量，提示該藥可在一定范圍內可抑制骨吸收，減少骨丟失。另外，與空白組比較，模型組血鈣降低而血磷升高，則進一步說明維甲酸誘導骨代謝活躍、骨轉換率升高。而各給藥組血鈣、血磷逐步趨于正常，這可能與藥物促進胃腸道對鈣磷的吸收有關。骨鈣素（BGP）水平增高，多見于高轉換型骨質疏松癥[10]。本實驗造模后小鼠呈高轉換型骨質疏松，給小鼠灌服骨碎補醇提物后骨轉換水平下降。雌激素對骨代謝的調節是復雜的，多途徑的，既有促進作用，又有抑制作用[11]。實驗中發現模型組雌二醇水平明顯降低，這也與維甲酸導致性腺損傷的報道一致。骨碎補醇提物用藥組體內雌二醇水平有不同程度的升高，特別是高劑量組較明顯，從而證實骨碎補醇提物具有類雌激素樣作用。

綜上所述，骨碎補醇提物能夠提高血清雌激素水平、抑制骨高轉換率，使骨代謝趨于平衡，對維甲酸誘導的小鼠骨質疏松癥具有一定的預防作用。

參考文獻：

[1]中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會.原發性骨質疏松癥診治指南（2011年）[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2011，1：2-17.

[2]宋雙紅，余倩，王喆之，等.骨碎補防治骨質疏松研究概況[J].生命的化學，2015，35（1）：73-80.

[3]王婷，張金超，楊夢，等.抗骨質疏松的單味中藥及藥用植物研究進展[J].中國中藥雜志，2006，31（9）：718.

[4]陳順，關延彬.骨碎補藥理作用的研究進展[J].醫藥導報，2006，25（7）：685.

[5]Jeong J C，Lee J W，Yoon C H，et al.Stimulative effects of Drynariae Rhizoma extracts on the proliferation and differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 Cells[J].Journal of Ethnopharmacology，2005，9（3）：489-495.

[6]Li F，Meng F，Xiong Z，et al.Stimulative activity of Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm.extracts and two of its flavonoids on the proliferation of osteoblastic like cells[J].Pharmazie，2006，61（11）：962.

[7]張上上，劉心晏，鄭姝寧，等.骨碎補醇提物對骨質疏松預防作用的大鼠尿液UPLC-MS/MS代謝組學研究[J]中國中藥雜志.2012，01：658-662.

[8]陳琦，薛存寬，沈凱，等.紅車軸草異黃酮對去勢大鼠骨質疏松影響的實驗研究[J].中國醫師，2005，8（7）：538-540.

[9]楊茗，季暉，戴勝軍，等.知母皂苷元對維A酸致小鼠骨質疏松的防治作用[J].中國天然藥物，2006，4，（3）：219.

[10]Raff H，Raff J L，Duthie E H，et al.Elevated Salivary Cortisol in the Evening in Healthy Elderly Men and Women：Correlation With Bone Mineral Density[J].Journals of Gerontology，1999，54（9）：S24.

[11]周振雷，侯加法.雌激素對骨代謝的調節作用[J].中國臨床康復，2004，8（14）：2714.

編輯/成森