［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的轉化與篩選

［KH－*3D］邢小龍，常紀蘋，付忠軍，胡德升，胡彥民*

(1．河南農業大學農學院/河南糧食作物協同創新中心，河南鄭州450002;2．重慶市農業科學院，重慶401329)

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的轉化與篩選

［KH－*3D］邢小龍1，常紀蘋1，付忠軍2，胡德升1，胡彥民1*

(1．河南農業大學農學院/河南糧食作物協同創新中心，河南鄭州450002;2．重慶市農業科學院，重慶401329)

為獲得轉基因抗蟲玉米，將［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因導入玉米，并進行鑒定和篩選。在［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的兩端分別添加Nco I和Bam H I酶切位點，并進行人工合成。將EβF合成酶基因與植物表達載體pFGC5941連接，經雙酶切和測序鑒定。結果表明:重組表達載體pFGC5941-EβF構建成功;載體pFGC5941-EβF轉化農桿菌EHA105后用玉米芽尖侵染法將EβF合成酶基因導入玉米自交系鄭58中，對轉化植株進行除草劑抗性篩選以及EβF合成酶基因和bar基因的PCR鑒定后，共得到18株轉基因陽性植株。

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因;玉米;表達載體構建;轉基因植株

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因是植物體內催化法尼基焦磷酸(FPP)合成EβF的關鍵酶基因。EβF作為大多數蚜蟲報警信息素的主要甚至唯一成分，是一種重要的倍半萜烯類化合物［1－3］，當蚜蟲受到天攻擊時，其體內會產生EβF，以使其他蚜蟲逃離，從而停止對作物的危害。EβF對蚜蟲有強烈的驅避作用，并能吸引蚜蟲天敵，從而有較好的抗蚜效果。Beale等［4］將歐洲薄荷EβF合成酶基因轉入擬南芥，轉基因植株對蚜蟲產生警戒反應并吸引蚜蟲寄生性天敵蚜繭蜂。Foster等［5］研究發現，產生抗藥性的蚜蟲對EβF反應變得遲鈍，故利用EβF充分吸引蚜蟲天敵可有效控制抗藥性蚜蟲。

目前該基因已先后從歐洲薄荷，香橙，花旗松，黃花蒿中得到分離和鑒定［6－9］。近年來研究人員又將EβF合成酶基因成功導入擬南芥，煙草，水稻［10－12］等作物中，培育了多種轉基因抗蟲植株。筆者借鑒前人經驗，以EβF合成酶基因構建重組表達載體pFGC5941-EβF并轉入玉米自交系鄭58，得到轉化植株，然后進行鑒定和篩選，為獲得抗蟲玉米材料奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 供試材料

受體材料:鄭58，玉米優良自交系;菌株:大腸桿菌DH5α，根癌農桿菌EHA105，由本實驗室保存;［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;基因測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1．2 植物表達載體的構建

在［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因(1653 bp)兩端分別引入Nco I和Bam H I酶切位點，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成，得到兩端帶酶切位點的目的基因，并用Nco I和Bam H I對其進行雙酶切。將植物表達載體pFGC5941用Nco I和Bam H I雙酶切后回收載體骨架，表達載體骨架與目的基因按摩爾數之比1∶5的比例混合，然后加入2 μl 10×T4DNA Ligase buffer和1μl T4DNA連接酶，補足滅菌水至終反應體積20 μl，22℃連接30 min。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞、雙酶切和測序鑒定，以確定成功構建重組表達載體pFGC5941-EβF。

1．3 轉基因植株的轉化

培養大腸桿菌陽性克隆子，提取陽性大腸桿菌的質粒DNA，并用液氮凍融法轉化農桿菌，然后對其進行菌落PCR鑒定，培養陽性農桿菌，通過農桿菌侵染法轉化鄭58種子。

1．4 轉基因植株的PCR檢測

取轉化后的玉米植株葉片，采用CTAB法提取玉米基因組DNA。根據［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因序列設計PCR引物。EβF合成酶基因的上下游引物為EβF-F1，ccatggctacaaacggcgtc;EβF-R1，ggatcctcaaaagactatggcatcaacaaag擴增產物片段大小為1661 bp。PCR反應體系為25 μl 2×PCR buffer，1 μl dNTPs，0．2 μl DNA模板，上下游引物各2 μl，1 μl DNA Polymerase，加滅菌水至50 μl，PCR擴增程序為95℃預變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸90 s，進行35個循環最后72℃徹底延伸5 min。擴增產物用1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．5 轉基因植株的除草劑抗性檢測

將PCR檢測陽性的幼苗移栽至大田，自交授粉收獲種子。將收獲的玉米種子播種在營養缽內，放置人工氣候室內培養，待轉基因幼苗長至3葉期時，噴灑0．2%的PPT溶液進行除草劑篩選，每天1次，連續噴灑2，5 d后觀察結果。

2 結果與分析

2．1 重組表達載體pFGC5941-EβF的構建

用Nco I和Bam H I對質粒pFGC5941進行雙酶切，切去的片段大小為1388 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測，產生2條帶，大小與預期一致。切膠回收長度為10 017 bp的載體骨架。將目的基因與切膠回收得到的載體骨架用T4連接酶進行連接(圖1)。

2．2 重組表達載體鑒定

2．2．1 雙酶切鑒定重組表達載體pFGC5941-EβF經雙酶切后產生10 017 bp的大片段和1661 bp的目的小片段。

雙酶切鑒定結果表明，目的基因EβF合成酶基因已成功連接到pFGC5941載體上，構建的表達載體pFGC5941-EβF正確(圖2)。

2．2．2 測序鑒定重組表達載體構建后，轉化大腸桿菌，提取質粒，再對目的基因進行測序，經與目的基因進行比對，序列完全一致，測序結果見圖3。

2．3 轉基因植株獲得

經農桿菌介導的玉米芽尖遺傳轉化、轉化后植株的PCR檢測，共得到22株擬轉基因植株(圖4)。

2．4 轉化植株除草劑抗性分析

圖1 Nco I和BamH I雙酶切電泳圖Fig．1Electrophoretogram of products digested by double enzymes

圖2 重組表達載體pFGC5941-EβF的雙酶切鑒定Fig．2Identification of the recombinant expression vector pFGC5941-EβF by double enzyme digestion

22株擬轉基因植株自交授粉結實后，對其后代分別進行除草劑抗性篩選，幼苗長至3葉期時，噴灑0．2%的PPT溶液，每天1次，連續噴灑2 d，5 d后觀察結果。結果顯示，22株轉化玉米植株中18株表現出除草劑抗性，可初步確定這18株為轉基因陽性植株(圖5)。

圖3 EβF合成酶基因的測序Fig．3Sequence of EβF synthase gene

圖4 EβF合成酶基因PCR檢測Fig．4EβF synthase gene PCR detection of putative transformant

圖5 T1代植株除草劑篩選Fig．5T1 plantlets herbicide-resistant test

2．5 轉基因陽性植株PCR檢測

根據Bar基因序列設計PCR引物，上游引物為Bar-F1;gcaccatcgtcaaccactacat下游引物為Bar-R1，tgtgcctccagggacttca擴增產物片段大小為286 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，陽性對照及除草劑抗性植株均能擴增出目的基因片段，而陰性對照不能擴增出目的條帶。Bar引物擴增片段與預期大小286 bp相符。PCR檢測進一步確定了除草劑抗性的18株植株為轉基因陽性植株，表明抗蟲基因EβF合成酶基因已整合到玉米基因組中(圖6)。

圖6 Bar基因PCR檢測Fig．6Bar gene PCR detection of putative transformant

3 結論與討論

本研究將［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因與植物表達載體pFGC5941連接，成功構建pFGC5941-EβF重組表達載體，采用液氮凍融法轉化農桿菌EHA105，然后用農桿菌侵染玉米芽尖將EβF合成酶基因轉入玉米自交系鄭58，并對轉化植株進行PCR檢測和除草劑抗性篩選，共獲得18株轉基因陽性植株。

英國洛桑研究所2005年從歐洲薄荷中克隆到［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因，該基因有1653個核苷酸組成，編碼550個氨基酸［6］。由于［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因對蚜蟲有明顯的驅避作用［4，10，13］，該基因越來越多地被應用到基因工程中。本研究選用的35S啟動子是一種強啟動子，可提高轉基因玉米［反］-β-法尼烯(EβF)的表達水平，提高其抗蟲性，被廣泛應用于植物基因轉化中。為了得到更加純合的轉基因植株，需要對轉基因植株的后代進行進一步的分子檢測如Southern blotting和Western blotting等，經過連續多代自交篩選，可得到純合的轉基因植株。另外，EβF合成酶基因還可以與Bt基因或其他抗蟲基因構建雙價或多價抗蟲植物表達載體，拓寬抗蟲譜，培育出具有高效廣譜抗蟲性的轉基因玉米。

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(責任編輯 陳虹)

Transformation of(E)-β-farnesene Synthase Gene into Maize and Preliminary Screening

XING Xiao-long1，CHANG Ji-ping1，FU Zhong-jun2，HU De-sheng1，HU Yan-min1*
(1．College of Agronomy，Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops，Henan Zhengzhou 450002，China;2．Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China)

To obtain insect-resistant transgenic maize，(E)-β-farnesene synthase gene was transferred into maize，which was identified and screened．The Nco I and Bam H I enzyme cutting sites were separately added at both ends of the(E)-β-farnesene synthase gene．This sequence was artificially synthesized．The desired gene was ligated into vector pFGC5941 by double enzyme digestion and DNA ligase to construct ecombinant expression vector pFGC5941-EβF，which were sequenced and identified by double enzyme digestion．The result showed that the vector pFGC5941-EβF was successfully constructed．Then pFGC5941-EβF was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 that infected shoot apical growing point of maize Zheng58．The transgenic maize plants were identified by herbicide-resistant and PCR amplification for bar and EβF synthase genes，and a total of 18 positive transgenic maize plants were obtained．

(E)-β-farnesene synthase gene;Maize;Construction of expression vector;Transgenic plants

S513．038

A

1001－4829(2017)1－0001－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．001

2016－01－10

國家自然科學基金項目(31071431)

邢小龍(1989－)，男，河南舞陽人，從事玉米生物技術育種研究，E-mail:xingxiaolong2013@163．com，*為通訊作者:胡彥民，E-mail:huyanmin007@163．com。