不同程度低溫脅迫對凡納濱對蝦主要消化酶活性的影響

［KH－3D］何蘋萍，韋嬪媛，趙永貞，李強勇，陳曉漢，彭金霞

(廣西水產科學研究院，廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西南寧530021)

不同程度低溫脅迫對凡納濱對蝦主要消化酶活性的影響

［KH－*3D］何蘋萍，韋嬪媛，趙永貞，李強勇，陳曉漢，彭金霞*

(廣西水產科學研究院，廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西南寧530021)

研究不同程度低溫脅迫條件下凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)主要消化酶活性的變化規律，以期為低溫消化生理學及低溫條件下投喂餌料成分配比的調整提供參考。試驗設計20、16℃兩個溫度組，每組設計5個取樣時間點，每組以28℃(常溫)為對照組。對各組取樣實驗蝦的肝胰腺及胃腸進行胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶3種消化酶活性的測定。結果表明，3種消化酶在不同溫度下的活性順序均為28℃＞20℃＞16℃;3種消化酶活性順序為胰蛋白酶＞淀粉酶＞胃蛋白酶。淀粉酶及胃蛋白酶的活性順序為肝胰腺＞胃腸，胰蛋白酶活性順序為胃腸＞肝胰腺。3種消化酶的活性均為低溫處理24 h開始出現不同程度的降低，144 h活性達到最低值，回復常溫24 h后活性有所回升。3種消化酶受低溫影響程度為胃蛋白酶＞淀粉酶＞胰蛋白酶。20℃下消化酶活性與常溫相比降幅最小的為淀粉酶，16℃下消化酶活性與常溫相比降幅最小的為胰蛋白酶。生產中在不同溫度情況下應根據消化酶的活性來決定餌料成分的配比及投餌量，應隨著溫度的持續降低不斷減少總投餌量，降溫初期(常溫降至20℃)應以提高餌料的淀粉含量配比方式進行投喂;降溫后期(20℃降至16℃)應以提高蛋白含量配比方式進行投喂。

凡納濱對蝦;溫度;胃蛋白酶;胰蛋白酶;淀粉酶

凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)，俗稱南美白對蝦，占我國養殖對蝦總產量80%以上。廣西北部灣是我國凡納濱對蝦主產區之一，但凡納濱對蝦是暖水性品種，其存活、攝食及生長的適宜水溫為18～35℃，水溫18℃以下時，存活率降低，因此養殖效益受極端天氣、季節和地域的限制。研究表明，水產動物在低溫脅迫時，通過微效多基因表達調控，調整自身能量代謝水平和消化吸收能力等，從而適應低溫環境甚至實現正生長，消化酶的活性水平正是反映對蝦消化吸收能力的重要指標。目前對凡納濱對蝦成蝦消化酶的研究報道較少，常見的為凡納濱對蝦及中國對蝦幼體和仔蝦消化酶的研究［1－3］。黃燕華［4］及沈文英［5］均使用酶學的方法進行凡納濱對蝦成蝦幾種主要消化酶體外最適反應溫度的研究，但酶學研究存在一定的局限性及誤差，生理生態學研究方法更具生產實踐方面的指導意義。目前運用生理生態學方法對消化酶活性進行研究的有:溫度對中華原鉤蝦消化酶活性的影響［6］、饑餓對克氏原螯蝦消化酶活性的影響［7］、鹽度對凡納濱對蝦幼蝦消化酶活性的影響［1］等。本研究為國內首次采用生理生態學方法研究不同程度低溫脅迫條件下凡納濱對蝦主要消化酶活性的變化規律，以期為凡納濱對蝦低溫消化生理研究及低溫條件下投喂餌料成分配比的調整提供參考。

1 材料與方法

1．1 實驗用蝦

實驗所用蝦為廣西水產科學研究院南美白對蝦遺傳育種中心選育的耐寒家系蝦。

1．2 低溫實驗

實驗設計3個溫度組，分別為28℃(常溫組)、20℃(低溫組)、16℃(低溫組)，每個低溫組又設降溫24、72、144 h和恢復常溫24 h共5個實驗組。每組實驗用蝦10只，取各組別實驗蝦的肝胰腺及胃腸組織凍存。

1．3 樣品制備

1．3．1 肝胰腺將凍存的肝胰腺取出，稱重，加5倍體積的4℃預冷生理鹽水，在冰浴中用玻璃勻漿器勻漿2 min，勻漿液在4℃下2500 r/min離心10 min，取上清液備用。

1．3．2 胃腸將凍存的胃腸組織取出，稱重，加10倍體積的4℃預冷生理鹽水，在4℃冰浴的研缽里研磨，勻漿液在4℃下2500 r/min離心10 min，取上清液備用。

1．4 酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒分定胃腸及肝胰腺的胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、蛋白總量。胃蛋白酶活性定義:每毫克組織蛋白在37℃每分鐘分解蛋白生成1微克氨基酸相當于1個酶活力單位。胰蛋白酶活性定義:在pH 8．0，37℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0．003即為1個酶活力單位。淀粉酶活性定義:組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個淀粉酶活力單位。

隨著研究的深入，網絡輿情研究逐步擴展到思想政治教育、高校管理、政治發展、倫理文化及群體性事件的預防等方面。其成果有四個方面：

1．5 數據分析

試驗數據以平均值±標準誤差表示。在進行數據分析時，先將各組數據進行單因素方差分析，若結果差異顯著，再采用Duncan，s多重比較檢驗組間差異。所有統計分析均使用SPSS 16．0軟件處理，以P≤0．05作為差異顯著性標準。

2 結果分析

2．1 溫度對凡納濱對蝦胃蛋白酶活性的影響

不同低溫處理時間下凡納濱對蝦胃蛋白酶活性呈現出一定的變化規律。隨著低溫處理時間的延長，凡納濱對蝦肝胰腺及胃腸組織胃蛋白酶均呈現逐漸下降的趨勢。16℃低溫處理144 h組肝胰腺組織胃蛋白酶［(1．35±0．19)U］(圖1)，比常溫組［(4．14±0．83)U］下降67．39%。同時，16℃低溫處理144 h組胃腸組織胃蛋白酶［(1．03±0．25)U］，比常溫［(2．72±0．44)U］下降了62．13 %;20℃低溫處理144 h組肝胰腺組織胃蛋白酶［(2．31±0．62)U］(圖2)，比常溫組［(4．24±0．84)U］下降了45．52%。同時，20℃低溫處理144h組胃腸組織胃蛋白酶［(1．26±0．07)U］，比常溫組［(2．6±0．3)U］下降了51．54%。多重比較檢驗表明，肝胰腺胃蛋白酶活性及胃腸(16℃組)在處理24、72、144 h及回溫組與常溫組均存在顯著差異(P＜0．05)，而胃腸組織(20℃組)胃蛋白酶活性在低溫處理72、144 h及回溫組與常溫組存在顯著差異(P＜0．05)。多重比較檢驗表明，兩組低溫組的兩種組織與常溫組胃蛋白酶活性存在顯著差異(P＜0．05);16℃組與20℃組肝胰腺組織胃蛋白酶活性存在顯著差異(P＜0．05)，而胃腸組織則差異不顯著(P＞0．05)。

2．2 溫度對凡納濱對蝦胰蛋白酶活性的影響

圖1 16℃不同低溫處理時間下胃蛋白酶活性的變化Fig．1The change of activities of pepsase at different time under 16℃

不同低溫處理時間下凡納濱對蝦胰蛋白酶活性呈現出一定的變化規律。隨著低溫處理時間的延長，凡納濱對蝦肝胰腺及胃腸組織胰蛋白酶均呈現逐漸下降的趨勢，16℃低溫處理144 h組肝胰腺組織胰蛋白酶［(3605．31±298．38)U］最低(圖3)，比常溫組［(5954．42±768．57)U］下降了39．45 %;同時，16℃低溫處理144 h組胃腸組織胰蛋白酶［(5517．07±617．46)U］最低，比常溫組［(7857．72±467．69)U］下降了29．88%;20℃低溫處理144 h組肝胰腺組織胰蛋白酶［(3663．04±298．38)U］(圖4)，比常溫組［(5954．42±768．57)U］下降了38．48%;同時，20℃低溫處理144 h組胃腸組織胰蛋白酶［(5660．43±946．33)U］比常溫組［(7634．47±695．08)U］下降了25．86%。多重比較檢驗表明，肝胰腺胰蛋白酶活性在低溫處理24、72、144 h及回溫組與常溫組均存在顯著差異(P＜0．05)，而胃腸組織胰蛋白酶活性在低溫處理72、144 h及回溫組與常溫組存在顯著差異(P＜0．05)。多重比較檢驗表明，2組低溫組的2種組織與常溫組胰蛋白酶活性均存在顯著差異(P＜0．05);而16℃組與20℃組胰蛋白酶活性則差異不顯著(P＞0．05)。

表1 不同溫度下胃蛋白酶活性均值比較Table 1The activities of pepsase under different temperature

表2 不同溫度下胰蛋白酶活性均值比較Table 2The activities of trypsase under different temperature

圖2 20℃不同低溫處理時間下胃蛋白酶活性的變化Fig．2The change of activities of pepsase at different time under 20℃

圖3 16℃不同低溫處理時間下胰蛋白酶活性的變化ig．3The change of activities of trypsase at different time under 16℃

圖4 20℃不同低溫處理時間下胰蛋白酶活性的變化ig．4The change of activities of trypsase at different time under 20℃

2．3 溫度對凡納濱對蝦淀粉酶活性的影響

不同低溫處理時間下凡納濱對蝦淀粉酶活性呈現出一定的變化規律。隨著低溫處理時間的延長，凡納濱對蝦肝胰腺及胃腸組織淀粉酶均呈現逐漸下降的趨勢，16℃低溫處理144 h組肝胰腺組織淀粉酶［(6．083±1．09)U］(圖5)，比常溫組［(10．22 ±1．21)U］下降了40．48%。同時，16℃低溫處理144 h組胃腸組織淀粉酶［(4．38±0．61)U］，比常溫［(6．25±0．44)U］下降了29．92%;20℃低溫處理144 h組肝胰腺組織淀粉酶［(8．2±0．93)U］(圖6)，比常溫組［(10．67±1．15)U］下降了23．15%。同時，20℃低溫處理144 h組胃腸組織淀粉酶［(5．24±0．46)U］比常溫組［(6．16±0．36) U］下降了14．94%。多重比較檢驗表明，肝胰腺淀粉酶活性(16℃組)在處理24、72、144 h及回溫組與常溫組均存在顯著差異(P＜0．05)，肝胰腺淀粉酶活性(20℃組)在處理72 h、144 h及回溫組與常溫組存在顯著差異(P＜0．05)，而胃腸組織淀粉酶活性僅僅在低溫處理144 h及回溫組與常溫組存在顯著差異(P＜0．05)。多重比較檢驗表明，2組低溫組的肝胰腺淀粉酶活性均與常溫組存在顯著差異(P＜0．05)，2組低溫組淀粉酶活性之間也存在顯著差異(P＜0．05)。16℃組的胃腸組織淀粉酶活性與常溫組存在顯著差異(P＜0．05);而20℃組胃腸組織淀粉酶活性與常溫組差異不顯著(P＞0．05)。

圖5 16℃不同低溫處理時間下淀粉酶活性的變化Fig．5The change of activities of amylase at different time under 16℃

表3 不同溫度下淀粉酶活性均值比較Table 3The activities of amylase under different temperature

圖6 20℃不同低溫處理時間下淀粉酶活性的變化Fig．6The change of activities of amylase at different time under 20℃

2．4 不同組織器官消化酶活性比較

淀粉酶活性順序為:肝胰腺＞胃腸，胰蛋白酶活性順序為:胃腸＞肝胰腺，胃蛋白酶活性順序為:肝胰腺＞胃腸。3種消化酶活性順序為:胰蛋白酶＞淀粉酶＞胃蛋白酶。2種組織的A/P1均小于1，兩種組織的A/P2均大于1。

2．5 不同消化酶活性受低溫影響程度

3種消化酶受低溫影響程度為:胃蛋白酶＞淀粉酶＞胰蛋白酶。消化酶活性受低溫影響程度通過2個指標判斷:一是低溫處理144 h消化酶比常溫下降的幅度及回復常溫后消化酶升高的幅度。胰蛋白酶在3種消化酶之中是降低幅度最小，回升幅度最大的一種酶。

2．6 不同組織器官受低溫影響程度

2種組織受低溫影響程度為:肝胰腺＞胃腸。3種消化酶在低溫處理144 h后均為肝胰腺組織下降的幅度高于胃腸，回復常溫后均為肝胰腺組織消化酶升高的幅度低于胃腸。表明肝胰腺比胃腸更容易遭受低溫下的組織及功能損傷。

表4 不同器官主要消化酶活性及A/P值分析Table 4The activities of three digestive enzymes and the ratio of A/P in different organs

3 討論

本研究3種消化酶中胰蛋白酶的活性最高，且受低溫影響的程度最低;2種組織中胃腸組織受低溫影響程度最低，且不同溫度下胃腸組織的胰蛋白酶活性均顯著高于肝胰腺，表明無論是常溫還是低溫下凡納濱對蝦對飼料的消化吸收均主要依靠胃腸組織分泌的胰蛋白酶。這與劉玉梅［2］、潘魯青［3］、黃燕華［4］、李廣麗［8］等報道的在各自最適pH條件下，不同部位蛋白酶活力為肝胰臟顯著大于胃和腸的，蛋白酶主要分布于肝胰臟，肝胰臟蛋白酶分泌進入胃腸道后活力迅速下降的研究結論不相符，可能是研究方法的差異、種間差異或實驗對蝦生長階段的差異導致的。而Das［9］等研究發現，肝胰臟主要分泌蛋白酶原，其蛋白酶活力微弱或幾乎沒有，腸道分泌腸激酶，能激活蛋白酶原，共同促進腸道對食物蛋白質的消化吸收，與本研究結論一致;沈文英［5］等研究發現蛋白酶比活力在消化酶中最大，說明凡納濱對蝦具有較高的蛋白質消化能力，建議配制凡納濱對蝦飼料時可適當提高蛋白質含量，與本研究結論一致。另外梅景良等［10］對黑鯛(Sparus macrocephalus)體內蛋白酶活力的研究結果與相類似道。

本研究中3種消化酶在不同溫度下的活性順序均為:28℃＞20℃＞16℃。胰蛋白酶活性的常溫組與低溫組差異顯著，但2組低溫組之間差異不顯著;淀粉酶活性的常溫組與低溫組(20℃)差異不顯著，與低溫組(16℃)差異顯著。表明從常溫(28℃)降溫至20℃的過程中淀粉酶活性的降幅最小，從20℃降溫至16℃的過程中胰蛋白酶活性的降幅最小，換言之，在降溫初始蛋白酶活性下降較快，對蝦降低能量消耗及對蛋白的消化吸收，增強適應性。而淀粉酶沒有顯著下降，表明對蝦主要靠對淀粉的消化吸收維持自身正常存活。此結論與蘆光宇等［7］的研究結論一致。本研究3種消化酶隨著低溫處理時間變化的規律大致一致，均為低溫處理0 h消化酶活性無顯著變化，低溫處理24 h開始呈現消化酶活性顯著降低，低溫處理144 h消化酶活性達到最低值，回溫24 h后消化酶活性有所回升。區別在于淀粉酶活性在低溫處理24 h與常溫組及低溫0 h組并無顯著差異，直到低溫處理72 h活性才顯著降低，表明淀粉酶在凡納濱對蝦遭遇低溫的初始變化不明顯。李志華等［11］發現日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)分別饑餓2、4、8 d，胃蛋白酶和脂肪酶活性變化也均隨著饑餓時間的延長而降低，這與本研究結果相似。王輝報道奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×O．aureus)的幼魚在饑餓狀態下，體內胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶的活性顯著下降，但淀粉酶活性變化趨勢不明顯，與本研究結論相符［12］。這與在低溫初始24 h時淀粉酶活性呈現升高的文獻報道有所出入［13］，可能是研究方法的不同及物種差異導致的。吳垠報道由于飼料中蛋白質水平的差異而造成日本對蝦與中國對蝦在消化酶活性方面的差異現象十分明顯，表明可能是由于不同種類蝦在長期的環境適應中，通過自身調節機制來調節酶的合成與分泌及其與其它酶的對應關系而形成的［14］。Kawai等用魚粉和馬鈴薯淀粉含量不同的飼料飼養幼鯉75 d，發現在一個星期內，腸道麥芽糖酶、淀粉酶和蛋白酶活性對飼料呈現出適應性的變化規律［15］。因此不同溫度情況下應根據消化酶的活性來決定餌料成分的配比及投餌量，生產中遭遇低溫寒潮應隨著溫度的持續降低不斷減少總投餌量，在降溫初期(常溫降至20℃)應以降低飼料中蛋白含量配比，提高淀粉含量配比的方式進行投喂;降溫后期(20℃降至16℃)應以降低餌料的淀粉含量配比，提高蛋白含量配比的方式進行投喂。

甲殼動物消化酶活力在營養生理方面有重要作用，直接影響甲殼動物的生長、蛻皮和攝食［15］。目前，引起水生動物消化酶活力下降的原因主要有3個方面:①低溫脅迫時，水生動物通過微效多基因表達調控，降低自身能量代謝水平和消化吸收能力，即降低消化酶的分泌，進而自主減少進食;②水生動物因為整個消化道受到食物蠕動的機械刺激減少，因而消化酶分泌量進一步明顯下降［16］;③由饑餓引起的肝胰臟萎縮、胃壁變薄、腸管收縮等消化器官的實質性變化，必將導致這些器官的消化酶分泌量進一步降低傷［17］。本研究中，低溫處理7 d回復常溫1 d以后消化酶活性較低溫處理7 d時有所回升，表明低溫處理7 d暫時沒有對蝦的肝胰腺、胃腸組織造成不可逆的損。

Biesiot等［18］提出采用淀粉酶/胃蛋白酶(A/ P1)比值和淀粉酶/胰蛋白酶(A/P2)比值作為食性和營養狀況的指標來指導投餌，比值高為植物食性或偏植物食性，比值低為動物食性或偏動物食性，本試驗測定凡納濱對蝦的A/P1小于1，A/P2比值大于1，但A/P1遠小于1，而A/P2只是稍大于1，表明凡納濱對蝦的食性為動物食性或偏動物食性。因此在凡納濱對蝦的養殖過程中，投餌種類應以動物性餌料或蛋白含量高，而脂肪和淀粉含量低的配合性飼料。

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(責任編輯 溫國泉)

Effects of Different Low Temperature Stress on Activities of Digestive Enzymes in Penaeus vannamei

HE Ping-ping1，WEI Pin-yuan，ZHAO Yong-zhen，LI Qiang-yong，CHEN Xiao-han，PENG Jin-xia*
(Guangxi Academy of Fisheries Science，Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，Guangxi Nanning 530021，China)

The change rule of activities of digestive enzyme in Penaeus vannamei under different low temperature stress was researched to provide reference for cold digestion physiology and the change of proportioning of bait under low temperature．The experiments were conducted at 2 different low temperature，20℃and 16℃，each group was designed for five sampling time point，and 28℃was control for each group．The pepsase，trypsase and amylase in the hepatopancrea and gastrointestinal tract of each group of experimental prawn were test．The results showed that the activity order of digestive enzymes under different temperature was 28℃＞20℃＞16℃．The activity order of digestive enzymes was trypsase＞amylase＞pepsase．The activity order of pepsase and amylase was hepatopancreas＞gastrointestinal tract，the activity order of trypsase was gastrointestinal tract＞hepatopancreas．The activities of three digestive enzymes began to reduced significantly at low temperature for 24 hours(P＜0．05)，reduced to minimum until 144 h，and rose affer restore normal temperature 24 h．The degree of digestive enzymes affected by low temperature were pepsase＞amylase＞trypsase．The activities of amylase decrease least from nomal among the digestive enzyme under 20℃，and trypsase under 16℃．In a word，the proportioning of bait and feeding quantity should depends on the activity of digestive enzymes under different temperature．Indicate that the feeding quantity should be reduced along with the continuous falling of temperature，the proportioning of amylum should be raised during the initial stage of cooling and the proportioning of protein should be raised during the later stage of cooling．

Penaeus vannamei;Temperature;Pepsase trypsase;Amylase

S985．2+1

A

1001－4829(2017)1－0233－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．040

2016－09－09

國家自然科學基金項目(31460690);八桂學者建設專項資金(BGXZ-NMBDX-05);現代農業產業技術體系建設專項(CARS-47);廣西壯族自治區直屬公益性科研院所基本科研業務專項(GXIF-2014-002)

何蘋萍(1984－)，女，碩士，廣西柳州人，助理研究員，主要從事水產遺傳育種與分子輔助選育研究，*為通訊作者，E-mail:269679250@qq．com。