高粱種子萌發期耐低溫材料的篩選與鑒定

［KH－*D］張麗霞，張明政，張靈敏，霍巖，4，王春語，叢玲

(1．遼寧省農業科學院創新中心，遼寧沈陽110161;2．遼寧省莊河市鞍子山鄉農業技術服務站，遼寧莊河116414;3．遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧錦州121000;4．內蒙古赤峰市農牧科學研究院高粱研究所，內蒙古赤峰024031)

高粱種子萌發期耐低溫材料的篩選與鑒定

［KH－*3D］張麗霞1，張明政2，張靈敏3，霍巖1，4，王春語1，叢玲1

(1．遼寧省農業科學院創新中心，遼寧沈陽110161;2．遼寧省莊河市鞍子山鄉農業技術服務站，遼寧莊河116414;3．遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧錦州121000;4．內蒙古赤峰市農牧科學研究院高粱研究所，內蒙古赤峰024031)

篩選、鑒定耐低溫高粱材料及挖掘耐低溫基因能極大地促進高粱耐低溫品種的培育。本研究利用全球收集的631份高粱材料經過8、6、4和2℃逐步低溫處理的方法篩選鑒定，同時統計了高粱粒色與耐低溫、染菌率的關系。最終篩選到7份耐低溫較強的高粱材料，其中1份來自中國的帚用高粱在2℃低溫處理14 d后仍有較高的相對萌發率和相對出苗率。高粱種子萌發期，白粒高粱最易染菌，黃粒高粱次之，紅粒高粱染菌率最低。耐低溫級別高的材料不同粒色都有分布。表明6℃或更低溫度對種子的萌發率和出苗率都具有非常大的影響。隨著高粱粒色的逐漸加深，染菌率逐漸降低。

高粱;種子萌發;低溫脅迫;相對萌發勢;相對萌發率;相對出苗率

植物的抗寒性包括凍害(零下低溫)和冷害(零上低溫)，常規大田作物在整個生育期遭遇零下低溫的極端天氣很少，但冷害現象卻時常發生。關于水稻耐低溫品種的篩選鑒定、耐低溫相關基因的定位克隆、耐低溫分子調控機制研究以及水稻耐低溫育種等方面都有較深入研究［1－4］。玉米關于耐低溫的研究報道也較多，鑒定篩選出的耐低溫種質資源在實踐生產和育種中有重要作用［5－6］。

關于高粱低溫冷害方面的研究國內外都有相關報道。在20世紀80年代初，我國就相繼開展了關于高粱耐低溫材料的篩選、鑒定等研究工作［7－12］。Major(1982)等對Pride P130高梁苗期進行短期低溫處理，發現低溫雖使開花延遲3 d、分蘗增多，但對株高、葉數、籽粒產量、粒數或粒重的影響較小［13］。Knoll等利用Shan Qui Red(耐低溫品種)和SRN39 (低溫敏感品種)構建的RIL群體挖掘耐低溫相關的QTLs［14－15］。Bekele等揭示在低溫脅迫下高粱苗期耐低溫的遺傳復雜性，且挖掘與非生物脅迫相關的QTLs［16］。但是有關高粱低溫相關研究不多，篩選鑒定的方法、指標等不完善，高粱耐低溫QTLs、基因挖掘的研究報道較少，基本沒有在生產實踐中應用。目前高粱生產實踐中較為突出的問題之一是高粱播種后遭遇低溫，影響種子活力導致出苗率低或在土壤中“粉種”、霉爛，給高粱生產帶來較大損失［17－19］。為了促進和加快高粱育種工作，深入開展高粱耐低溫研究，首先必須篩選鑒定出適用于生產實踐的耐低溫材料，也為進一步定位、克隆耐低溫基因以及揭示高粱耐低溫的分子機制奠定基礎。

低溫條件下，萌發勢和萌發率是評價材料耐低溫的重要指標之一，本研究利用人工氣候箱對從中國以及其他世界各地收集的631份高粱材料進行種子萌發期耐低溫材料篩選、鑒定，從中篩選出優良的耐低溫材料以供后期研究使用。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

本試驗收集了中國以及全球不同地區(非洲、亞洲、美洲和北美洲等)、不同類型(甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和國內農家種)的高粱材料631份，其中包括國際熱帶半干旱地區作物研究所(ICRISAT)提供的微核心種質243份，中國國家作物種質庫中期庫提供國內農家種251份，遼寧省農業科學院創新中心國家高粱改良中心提供甜高粱、草用高粱和國內常規品種等136份和通遼市農科院提供選育品種1份。地區的廣泛性和品種的多樣性更有利于篩選到優良的耐低溫材料。

1．2 試驗方法

利用國產MGC-350HP-2型人工氣候箱(上海一恒科學儀器有限公司)，對收集到的631份高粱材料8℃低溫脅迫處理8天后統計種子的相對萌發勢，14 d后統計種子的相對萌發率，隨后置于25℃人工氣候室的培養架上5 d后統計相對出苗率。萌發以種子露白為標準，出苗以2片子葉完全展開為準。

選取籽粒飽滿、均勻一致且無病蟲害的風干種子100粒，放在墊有毛巾的發芽盒中，加入一定量的無菌水，使毛巾保持濕潤的狀態。將發芽盒置于人工氣候箱進行低溫處理。對照材料置于25℃培養架上3 d后統計種子的萌發率，萌發5 d后統計種子的出苗率。

相對萌發勢=(處理后8 d種子的實際萌發率/對照種子萌發率)×100%

相對萌發率=(處理后14 d種子的實際萌發率/對照種子萌發率)×100%

相對出苗率=(處理后種子的實際出苗率/對照種子出苗率)×100%

試驗重復2～3次，求平均值進行統計。

統計標準如表1，耐低溫級別達到一級的材料繼續進行6、4和2℃的低溫篩選，14 d后統計相對萌發率，隨后統計相對出苗率。

表1 相對萌發勢、相對萌發率和相對出苗率統計標準Table 1The statistical standards of relative seed germination vigor，relative germination rates and relative seedling-emergence rates

2 結果與分析

2．1 低溫處理對種子相對萌發勢、相對萌發率和相對出苗率的影響

低溫條件下，種子的萌發勢和萌發率是評價品種耐低溫的重要指標之一［20］。前人研究結果表明，高粱萌發的最低土溫為8～10℃，最適溫度為20～30℃，出苗的最低溫度為10～12℃，超過20℃出苗率顯著增高［9，13，21］。因此，選擇8℃處理8 d后統計相對萌發勢、14 d后統計相對萌發率、25℃生長5 d后統計相對出苗率，統計標準如表1所示，作為高粱種子萌發階段耐低溫材料的篩選條件。供試的631份材料中相對萌發勢達到一級、二級、三級、四級、五級和六級的樣品數分別為21、39、48、51、61和411份，占總樣品比例分別為3．3%、6．2%、7．6 %、8．1%、9．7%和65．1%。相對萌發率達到一級、二級、三級、四級、五級和六級的樣品數分別為91、120、102、88、78和152份，占總樣品比例分別為14．42%、19．02%、16．16%、13．95%、12．36%和24．09%。相對出苗率達到一級、二級、三級、四級、五級和六級的樣品數分別為308、157、72、45、34和15份，占總樣品比例分別為48．81%、24．88%、11．41 %、7．13%、5．39%和2．38%(圖1)。25℃培養條件下，3 d后種子萌發率達到最大值。由此可見，8℃低溫處理不同程度上影響了種子的萌發勢、萌發率和出苗率。利用DPS(Data Processing System)數據處理系統分析了8℃低溫脅迫處理后相對萌發勢和相對萌發率的相關性，結果表明，相關系數r為0．66、P值為0．0001(相關系數臨界值a=0．05時，r= 0．09;a=0．01時，r=0．12)達到極顯著正相關，即相對萌發勢高的材料最終的相對萌發率也高。一般情況下，大部分材料符合此規律，但也存在8℃低溫脅迫處理8 d后相對萌發勢較低而處理14 d后相對萌發率卻很高的材料。比如相對萌發勢達到六級的411份材料中最終相對萌發率達到一級的材料共有18份，占相對萌發率達到一級材料的19．8%。8℃低溫處理14 d后置于25℃環境中統計相對出苗率，如圖1所示，相對出苗率達到55%以上的材料537份，占樣品總數的85．1%。由此可見，8℃低溫處理對種子出苗率影響較小。

高粱種子在萌發過程中，8℃低溫處理主要是延遲了種子的萌發速度和抑制了部分種子的萌發。低溫處理條件下，不同高粱品種間的萌發勢和萌發率存在明顯差異。一般情況下，萌發速度快且萌發勢高的品種，萌發率也高;萌發速度慢且萌發勢低的品種，萌發率相應也低。雖有個別材料不符合這個規律，但低溫處理下種子的萌發勢和萌發率可以作為鑒定耐低溫品種的指標之一。

高粱最適萌發溫度為20～30℃，溫度越高，萌發越快，材料間差異不明顯，溫度越低，萌發越慢，有的材料萌發率特別低甚至不能萌發，品種間差異顯著。萌發階段，如果想從大量材料中篩選鑒定耐低溫級別較高的材料，適當降低脅迫溫度或者延長低溫脅迫時間。因此，把耐低溫級別達到一級的材料繼續進行更低溫度的脅迫處理，統計相對萌發率和相對出苗率。

首先，將8℃低溫處理條件下相對萌發率達到一級的91份材料置于6℃低溫處理14 d后統計相對萌發率，隨后置于25℃條件下生長5 d統計相對出苗率。如圖2所示，91份材料中相對萌發率達到一級、二級、三級、四級、五級和六級的樣品數分別為32、13、12、7、5和22份，占試驗樣品比例分別為35．16%、14．29%、13．19%、7．69%、5．49%和24．18 %。相對出苗率達到一級、二級、三級、四級和五級的樣品數分別為17、43、17、8和6份，占試驗樣品比例分別為18．68%、47．25%、18．68%、8．79%和6．59%。8℃低溫處理14 d后，相對出苗率達到一級和二級的樣品數分別為308和157份，占總材料的73．69%(圖1)。相對萌發率達到一級的91份材料6℃低溫處理14 d后，相對出苗率達到一級和二級的樣品數分別為17和43份，占總材料的65．93%(圖2)。6和8℃低溫處理雖然不同程度上影響最終出苗率，但兩者的變化趨勢相同，相對出苗率達到二級以上的樣品數達到60%以上。8℃低溫處理對出苗率影響較小，相對出苗率達到一級的材料為308份，占總材料的48．81%。6℃處理較耐低溫的91份材料，相對出苗率達到一級的材料為17份，占總材料的18．68%，與8℃相比相對出苗率明顯降低。其次，將6℃低溫處理相對萌發率達到一級的32份材料置于4℃處理14 d后統計相對萌發率和出苗率，只有7份材料萌發，其他材料均未萌發，其中2份材料相對萌發率達到60%以上且相對出苗率也達到80%以上(表2)。最后，將篩選到的7份材料置于2℃低溫處理14d后，只有1份來自中國的帚用高粱具有較高的相對萌發率(32．09 %)和相對出苗率(78．04%)，其余材料未萌發或萌發率特別低。

圖1 供試高粱材料相對萌發勢、相對萌發率和相對出苗率Fig．1The relative seed germination vigor，relative germination rates and relative seedling-emergence rates of tested sorghum materials

圖2 91份高粱材料相對萌發率和相對出苗率Fig．2The relative germination rate and relative seedling-emergence rates of tested sorghum materials

表2 供試材料的相對萌發率和相對出苗率Table 2The relative germination rate and relative seedling-emergence rate of tested sorghum materials

2．2 粒色與耐低溫的關系

本研究所用的631份材料中，粒色為白色、黃色和紅色的材料分別為153、61和417份，占總材料的24．25%、9．67%和66．09%。相對萌發率達到一級的材料共有91份，其中白粒47份、黃粒7份和紅粒37份，分別占相對萌發率達到一級材料的51．65 %、7．69%和40．66%(表3)。

張桂香等對238份高粱材料進行了高粱芽期耐冷性鑒定與評價，從中篩選出芽期耐冷種質15份，其中白粒5份、黃粒2份、紅粒7份及褐色粒1份，表明高粱材料的耐冷性與粒色有某種關系，耐低溫級別高的材料粒色大都表現為較深的顏色［12］。本研究中8℃低溫處理后相對萌發率達到一級的白粒材料47份，占白粒材料的30．72%;黃粒7份，占黃粒材料的11．48%;紅粒37份，占紅粒材料的8．87 %(表3)。紅粒材料最多，但篩選到的較耐低溫材料比例卻最低，和前人的研究結果正好相反。因此，關于高粱粒色與耐低溫的關系還有待進一步地分析研究。

表3 高粱粒色Table 3The sorghum grain color

表4 粒色與染菌情況Table 4The sorghum grain color and infection rates

2．3粒色與染菌的關系

如表4所示，粒色為白色的材料153份，其中8℃低溫處理14后沒有染菌的材料16份，染菌的材料137份，分別占白粒材料的10．46%和89．54%。黃粒材料61份，黃粒沒有染菌29份，黃粒染菌32份，分別占黃粒材料的47．54%和52．46%。紅粒材料417份，其中沒有染菌373份，染菌44份，分別占紅粒材料的89．45%和10．55%。由此可見，白粒材料最易染菌，紅粒材料染菌率較少，隨著粒色顏色的加深，染菌率逐漸降低。

高粱種子在低溫高濕的環境下容易產生爛種的危險，染菌率高及染菌嚴重將增加爛種的機會。春季播種時，如果處在低溫高濕的環境如有可能盡量選擇粒色較深的材料，盡量減少爛種的機會，保證出苗率。

3 討論與結論

由于播種地點和播種時間的差異，在早春播種時，高粱常常受到低溫脅迫因而影響種子萌發、出苗以及后期的植株生長，最終影響產量［22］。低溫損傷已經嚴重影響高粱生產，高粱冷害問題也越來越受到人們的重視。因此，篩選耐低溫種質資源、挖掘耐低溫基因、應用到今后的品種選育中顯得尤為重要。

關于低溫對高粱生產的影響以及耐低溫材料的篩選已有相關報道。潘鐵夫等對吉林省全省(以長春為代表)、蛟河(溫度較低)和懷德(溫度較高)等地區1950－1975年連續統計了26年低溫對高梁產量的影響以及低溫對高梁生長發育的影響等，統計數據顯示抽穗灌漿期低溫對高粱的產量影響最為顯著，且低溫對高梁生長發育的各個時期都有明顯的延遲作用［23］。陳香蘭等利用國內外1398份高粱開展了種子萌發期和幼苗期的耐低溫篩選鑒定，其中利用471份高粱材料進行種子萌發期的耐低溫篩選，篩選條件是4℃低溫處理7 d后置于25～30℃培養箱中培養3～5 d統計萌發率，萌發率達到85 %以上的材料有217份，占試驗材料的46%［7］，也就是說近一半的材料萌發率都很高，篩選條件不夠苛刻，難以篩選出極端耐低溫的材料，無法應用到生產實踐。

田間進行高粱低溫篩選誤差較大，每年同期氣溫變化較大，難以保證試驗的重復性。紀秀媛早在1978－1980年間對朝陽地區晉雜一號高粱采取分期播種方法找出了低溫災害發生的時間、指標、特點、類型及防御措施，但由于試驗品種單一，不利于其他地區選擇耐低溫品種［24］。馬世均等對國內外不同生態類型的115份高粱材料進行低溫處理篩選耐低溫品種，檢測低溫條件下不同品種的種子吸水量與種子萌發率的關系以及干胚膜脂肪酸組分差異與品種耐低溫的關系［10］。張桂香等對來自中國、美國和印度等國505份高粱品種進行了種子萌發期、芽期和苗期室內耐低溫篩選，根據實驗數據確定種子萌發階段，1～2℃處理5～8 d后12～15℃統計最終的出苗率，認為此方法能更好地反映出不同品種出苗率的差異性以達到優勝劣汰的目的［12］，但是采用的505份材料中到底有多少份材料出苗率表現一級抗性等具體數據未見報道。

631 份供試高粱材料經過8℃低溫脅迫處理，相對萌發勢、相對萌發率和相對出苗率達到一級的材料分別為21、91和308份，占總材料的3．33%、14．42%和48．81%(圖1)。8℃低溫處理明顯抑制了種子的萌發勢和萌發率，但對最終的出苗率影響較小。相對萌發率達到一級的91份材料經過6℃低溫處理后，相對萌發率和相對出苗率達到一級的材料分別為32和17份(圖2)。隨后將32份材料進行4℃低溫處理，只有7份材料萌發，其中2份材料相對萌發率達到60%以上，5份材料相對出苗率超過70%以上。篩選到的7份耐低溫較強的材料經過2℃低溫處理后，其中1份來自中國的帚用高粱仍有較高的相對萌發率和相對出苗率(表2)。6℃或更低溫度對種子的萌發率和出苗率都具有非常大的影響。

高粱種子萌發期，白粒高粱最易染菌，黃粒高粱次之，紅粒高粱不易染菌。隨著高粱粒色的逐漸加深，染菌率逐漸降低。

致謝:對本研究材料的提供方遼寧省農業科學院創新中心國家高粱改良中心、國際熱帶半干旱地區作物研究所、中國國家作物種質庫中期庫和通遼市農科院表示感謝。材料收集過程中得到了國家高粱產業體系首席專家鄒劍秋老師的大力支持，在此提出特別感謝。

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(責任編輯 李潔)

Screening and Identification of Low-temperature Resistant Materials at Seed Germination Stage

ZhANG Li-xia1，ZhANG Ming-zheng2，ZhANG Ling-min3，HUO Yan1，4，WANG Chun-yu1，CONG Ling1
(1．Innovation Center，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Liaoning Shenyang 110161，China;2．Anzishan Agricultural Technology Service Station of Liaoning，Liaoning Zhuanghe 116414，China;3．College of Food Science and Engineering，Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121000，China;4．Sorghum Research Institute，Chifeng Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Inner Mongolia Chifeng 024031，China)

Screening and identification the low-temperature resistant materials and genes can greatly promote the cultivation of the low-temperature resistant varieties of sorghum．631 sorghum materials，from the whole world，were treated by the method of 8，6，4 and 2℃stepwise selection．Meanwhile，we discussed the relationship between sorghum grain color and low-temperature resistant property and the infection rate．7 higher low-temperature resistant materials were obtained，and 1 broom sorghum from China had the higher relative germination rate and relative seedling-emergence rate after 2℃low-temperature treatment for 14 d．Compared with yellow sorghum and red sorghum，white sorghum is easiest to infect bacteria at the seed germination stage．Red sorghum is most difficult to infect bacteria．More low-temperature resistant materials have different grain color．6℃or lower temperature treatment will have very significant effect on the germination rate and seedling-emergence rate．With the deepening of sorghum grain color，the infection rate is gradually reduced．

Sorghum bicolor;Seed germination;Low-temperature stress;Relative germination vigor;Relative germination rate;Relative seedling-emergence rate

S514

A

1001－4829(2017)1－0020－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．005

2016－02－23

國家現代農業產業技術體系項目“高粱重要抗性資源鑒定篩選與種質創新(CARS-06-01-06)”;遼寧省科技攻關項目“主要作物生物育種技術研究(2011208001)”;國家自然科學基金“高粱莖稈蠟層缺失突變體sb1基因克隆及功能研究(31500203)”。

張麗霞(1981－)，女，內蒙古烏拉特前旗人，博士研究生，助理研究員，研究方向:高粱、玉米抗逆基因挖掘及功能鑒定，E-mial:zhanglx993@sohu．com。