利用拮抗、ITS和RAPD技術(shù)對靈芝屬菌株分類的研究

［KH－*3D］王錦鋒，李晶，I．L．Datti，張健，林志魁，林占熺

(1．福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002;2．國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350002;3．福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

利用拮抗、ITS和RAPD技術(shù)對靈芝屬菌株分類的研究

［KH－*3D］王錦鋒1，2，李晶1，2，I．L．Datti2，3，張健2，3，林志魁2，3，林占熺2*

(1．福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002;2．國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350002;3．福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

為了更科學(xué)的對靈芝菌株進(jìn)行分類與鑒定，利用拮抗、ITS和RAPD技術(shù)對21株靈芝菌株進(jìn)行分類鑒定和遺傳多樣性分析。拮抗試驗結(jié)果表明，大部分菌株之間存在不同程度的拮抗作用，少數(shù)菌株之間沒有拮抗或拮抗極不明顯;ITS序列分析結(jié)果表明，21個菌株分為3個組，菌株間遺傳距離的變化范圍在0．000～0．072，平均遺傳距離為0．039，菌株1號(赤68)與3號(Ga15)的遺傳距離為0．000，證明其親緣性較近;RAPD結(jié)果表明，各菌株間的相似系數(shù)在0．83以上，所有菌株分為兩個組，4號(867)菌株單獨為1組，其它20個菌株為1組;相似系數(shù)在0．932的相似水平上，所有菌株分為14個組;1號菌株與3號菌株的相似系數(shù)則超過了0．95，有可能是同種異名。3種方法其結(jié)論一致，且能準(zhǔn)確鑒定21株靈芝親緣關(guān)系。

拮抗試驗;ITS序列分析;RAPD技術(shù);遺傳多樣性;親緣性

靈芝(Ganoderma lucidum Curtis P．Karst．)又稱瑞芝、瑞草，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中就有記載其藥用價值，在我國已有2000多年的栽培及應(yīng)用歷史［1］。1881年，靈芝首先被英國真菌學(xué)家Karsten命名，當(dāng)時該屬只有Polyporus lucidus一個種，因而這個種就成了單模式標(biāo)本，但遺憾的是沒有真正的靈芝標(biāo)本材料保存下來［2］。隨后各國的分類學(xué)家就根據(jù)認(rèn)為重要的形態(tài)特征對各自收集到的菌株進(jìn)行分類和定名，因此出現(xiàn)了不同地域有不同的靈芝菌種命名，導(dǎo)致了靈芝屬的命名混亂，同名異種和同種異名的現(xiàn)象普遍存在［3］。隨著靈芝產(chǎn)品的開發(fā)，建立一套靈芝菌種的保障體系尤為重要。拮抗性實驗因其快速、便捷等優(yōu)點，在真菌分類學(xué)上被廣泛的應(yīng)用，成為了初步研究菌株分類的一種方法［1－2］。White等［4－5］為真菌rRNA基因的ITS設(shè)計了3對特異引物可用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌。Williams和Welsh開創(chuàng)RAPD技術(shù)以來，該技術(shù)在食(藥)用菌研究領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用［6－7］。本文應(yīng)用拮抗試驗、ITS序列分析和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對收集的菌株進(jìn)行親緣關(guān)系研究，更好地對靈芝菌株進(jìn)行有效的鑒別和分類，進(jìn)一步開發(fā)利用靈芝資源，為靈芝產(chǎn)品進(jìn)入國際市場提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試菌株的實驗編號及相關(guān)信息

本實驗所用菌株均由國家菌草工程技術(shù)研究中心提供，具體編號見表1。

表1 供試菌株實驗編號Table 1Sources of strains and tested number

1．2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒和膠回收盒購于OMEGA公司，2×Taq PCR MasterMix和6×Loading Buffer購于TIANGEN公司，Marker Plus(D2000 Plus)購于Gen-Star公司，核酸染料和RNaseA購于索萊寶公司。

S1000TMThermal Cycler型PCR儀和PowerPacTMBasic型電泳槽購于BIO-RAD公司，G:Box F3型高級凝膠成像系統(tǒng)購于SYNGENE公司。

1．3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g煮熟30 min后過濾，濾液中加入葡萄糖20 g，KH2PO41．0 g，MgSO4· 7H2O 0．5 g，定容至1 L，pH自然。

1．4 基因組DNA的提取

1．4．1 菌絲體培養(yǎng)將靈芝菌種接種到滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8～10 d，收集新鮮菌絲體備用。

1．4．2 DNA提取與檢測按OMEGA DNA提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA提取，提取的樣品DNA在1%瓊脂凝膠電泳(120 V，30 min)，核酸染料染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察DNA的電泳條帶。

1．5 拮抗實驗

擔(dān)子菌體細(xì)胞的非親和性(Samatic incompatibility)即高等擔(dān)子菌在雙核菌絲階段發(fā)生的認(rèn)識自我和排斥異己的過程。遺傳背景明顯不同的個體在交界區(qū)會形成明顯的分界線，該現(xiàn)象稱為拮抗反應(yīng)［8］，是體細(xì)胞非親和性的具體體現(xiàn)。將不同菌株活化后，在同一平板上按“品”字形接種3個菌株，25℃恒溫下培養(yǎng)，觀察菌絲間的拮抗反應(yīng)情況并做記錄。

1．6 ITS實驗

選用兩條特異引物ITS1和ITS4對21個菌株的基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增(表2)。25 μl的反應(yīng)體系為:2×Taq PCR MasterMix 12．5 μl、引物ITS1 1 μl、引物ITS4 1 μl、DNA 1 μl、ddH2O 9．5 μl。ITS擴(kuò)增反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30次循環(huán)后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物于1．5%瓊脂糖凝膠上電泳后拍照記錄，純化后送專業(yè)機(jī)構(gòu)測序。

1．7 RAPD實驗

選用10個隨機(jī)引物對21個菌株進(jìn)行擴(kuò)增(表3)。25 μl的反應(yīng)體系為:2×Taq PCR MasterMix 12．5 μl、Primer 1 μl、DNA 1 μl、ddH2O 9．5 μl。RAPD擴(kuò)增反應(yīng)程序為:92℃預(yù)變性5 min，然后92℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，進(jìn)行35次循環(huán)后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物于1．5%的瓊脂凝膠上電泳后拍照記錄。

表2 ITS特異引物及其序列Table 2ITS specific primers and sequences

表3 RAPD隨機(jī)引物及其序列Table 3RAPD random primers and sequences

1．8 數(shù)據(jù)處理分析

使用MEGA5．0和Clustal X軟件進(jìn)行ITS序列分析，并構(gòu)建聚類分析樹狀圖。RAPD分子標(biāo)記分析通過在瓊脂凝膠上DNA條帶出現(xiàn)與否分別記為1和0。用Gel-Pro analyzer和UPGMA(NTSYS2．1)軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖［8］。

2 結(jié)果與分析

2．1 拮抗實驗

圖1 顯示，2、18和19號菌株之間有拮抗性;9與3號菌株以及8號菌株之間有拮抗性，而3和8號菌株之間沒有拮抗性。

圖1 部分供試菌株間的拮抗現(xiàn)象Fig．1Antagonistic phenomena of section strains

表4 表明，1號菌株與3、8、10、21號菌株;2號菌株與6、9號菌株;3號菌株與5、7、8、10、11、20號菌株;5號菌株與19號菌株;6號菌株與9號菌株;8號菌株與10、20、21號菌株;10號菌株與18號菌株;14號菌株與16號菌株;17號菌株與19號菌株; 20號菌株與21號菌株間沒有拮抗反應(yīng)或拮抗性反應(yīng)極不明顯，說明其親緣關(guān)系很近。而其它各菌株之間都有著不同程度的拮抗反應(yīng)，這表明菌株之間的親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)。

2．2 ITS序列分析

采用特異性引物ITS1和ITS4對供試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得約650 bp的單一條帶(圖2)，經(jīng)切膠回收后進(jìn)行序列分析。

21株供試菌株的ITS序列依次與GenBank中已登錄的11條ITS序列(其中10條為靈芝菌株ITS序列，1條為香菇ITS序列)進(jìn)行相似性比對，采用MEGA5．0軟件對比對結(jié)果以Neighbor-Joining(鄰接法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。分支上的數(shù)字為利用Bootstrap分析(重復(fù)1000次)獲得的可信度。由圖3可看出，21株菌株大致分為3個群，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ(圖中的AB286065．1為香菇序列號)。GroupⅠ包括17、19、5、11、1315號和16號;GroupⅡ包括2、6、9、4和12號;GroupⅢ包括8、10、14、1、3、7、18、20和21號。根據(jù)Liao等［9］報道G．sichanense，G．weberianum和G．tenue的相似性很大(94．3%)。Renske等［10］報道的觀點，即當(dāng)序列的相似度達(dá)到99%以上，即可以判定為同一個種。因此，21株菌株的親緣性很近，種內(nèi)多樣性程度低。

表4 不同供試菌株間的拮抗反應(yīng)情況Table 4Antagonistic situation of different Ganoderma strains

圖2 21株供試菌株的ITS-PCR凝膠電泳圖Fig．2ITS-PCR gel electrophoresis of 21 tested strains

經(jīng)MEGA5．0軟件的分析得出21株靈芝菌株測得的序列之間的遺傳距離(表5)。21株菌株間遺傳距離的變化范圍在0．000～0．072，平均遺傳距離為0．039，菌株間的遺傳距離都比較小，表明它們之間的遺傳關(guān)系都比較近。

2．3 RAPD分析

通過選取的10條隨機(jī)引物(表3)對供試樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用Gel-Pro analyzer軟件對條帶進(jìn)行分析，共產(chǎn)生200條條帶，其中引物S32和S53的擴(kuò)增效果較好(圖4)。

采用UPGMA軟件對RAPD分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行聚類分析，建立遺傳相似距離矩陣(表6)以及聚類圖(圖5)。結(jié)果表明，21株菌株相互間的遺傳相似距離在0．807～0．950，其中1和3號菌株的相似距離最大達(dá)到0．950，而最低相似距離為0．807，分別為4與8、10、12、14、15、16、20和21號菌株。相似距離矩陣結(jié)果表明，各菌株之間的親緣性都很近，親緣性最近的是1與3號，其結(jié)果與拮抗性實驗結(jié)果和ITS序列分析結(jié)果一致。

圖3 21株供試菌株的ITS序列分析樹狀圖Fig．3ITS sequence analysis dendrogram of 21 tested strains

圖4 引物S32和S53的RAPD電泳圖譜Fig．4RAPD electrophoresis map of S32 and S53

圖5 表明，當(dāng)相似系數(shù)在0．83時，所有菌株分為兩個群，4號菌株單獨為1組，其余20個菌株為1組。當(dāng)相似系數(shù)達(dá)到0．932時，所有菌株將分成14個組，1與3號菌株為1組，20與21號菌株為1組，14與16號菌株為1組，8與10號菌株為1組，2和 19號菌株為1組，5和7號菌株為1組，13和15號菌株為1組，其余的各單獨為1組。1與3號菌株的相似系數(shù)超過了95%。說明兩者的親緣性非常近，有可能來源于同一個菌株。

表5 供試菌株ITS序列間的遺傳距離矩陣Table 5Genetic distance matrix between the ITS sequences of test strain

3 討論

圖5 供試菌株的RAPD聚類圖Fig．5RAPD cluster diagram of the tested strains

我國作為食(藥)用菌生產(chǎn)大國，有種植超過一半品種的食(藥)用菌［11］。靈芝是最重要的藥用菌之一，其中赤芝是最主要的栽培品種，在中國已有上千年的歷史。但目前因為地域、標(biāo)準(zhǔn)、來源等原因，造成靈芝分類及命名混亂。在靈芝屬建立之后，分類學(xué)家們根據(jù)靈芝的形態(tài)特征對靈芝進(jìn)行分類，然而靈芝子實體的形態(tài)可能會隨外界因素及地域的影響而變化，根據(jù)形態(tài)來對靈芝進(jìn)行分類并不能完全建立一個穩(wěn)定的分類系統(tǒng)［12］。因此，為了保證菌株的可持續(xù)栽培，建立一個可靠的靈芝遺傳多樣性評價方法顯得尤為重要。

表6 供試菌株的遺傳相似距離矩陣Table 6Genetic similarity matrix of tested strains

拮抗反應(yīng)是細(xì)胞非親和性的具體表現(xiàn)，因其直觀、快速和易實現(xiàn)的優(yōu)點而在真菌的親緣性關(guān)系的初步研究中得到廣泛的應(yīng)用［13－14］。拮抗反應(yīng)在一定時期內(nèi)作為真菌菌種鑒定的主要方法，但其也有一定的局限性，其往往很難區(qū)分出兩個在遺傳上有相似背景或者親緣關(guān)系很近的菌株［15－16］。因此目前在真菌的遺傳多樣性研究中只是用拮抗性實驗作為菌株鑒定的初步研究，更進(jìn)一步的研究就需要通過現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法［8］。

自從White等［4－5］人在1990年首次設(shè)計ITS引物對真菌核內(nèi)核糖體RNA基因進(jìn)行擴(kuò)增以來，ITS技術(shù)在真菌分類、鑒定的研究中應(yīng)用的越來越廣泛。由于ITS技術(shù)能實質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，且ITS的序列片段較小，研究人員可以從中獲得所需要的重要信息，易于分析。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或者近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育的研究［17－18］，已被證明在種間的水平上鑒定效果顯著［19］。Liao等［9］應(yīng)用ITS序列分析成功鑒定了來自亞洲和歐洲的靈芝并進(jìn)行了分類。Yan等［20］利用ITS技術(shù)和比較生態(tài)學(xué)研究了被一些人認(rèn)為是同種異名的Phialophora verrucose和Phialophora americana，得出了它們是不同種的結(jié)論。本文研究結(jié)果表明大部分靈芝是可以利用ITS序列分析成功進(jìn)行鑒定與分類，本研究還發(fā)現(xiàn)G．carnosum、G．pfeifferi、G．tsugae、G．weberianum、G．resinaceum、G．sessile跟赤芝(Ganoderma lucidum)的親緣性很近。

由于不同的物種的總DNA序列有所不同，因此與引物結(jié)合的位點及位點之間的距離也會有所差異應(yīng)用PCR擴(kuò)增后的具有多態(tài)性的DNA片段就可以比較全面的反映出物種的遺傳多樣性［8］，從而將不同種進(jìn)行區(qū)分。Yan等［21］應(yīng)用RAPD技術(shù)成功的區(qū)分了Auricularia auricular和Auricularia polytrichap。Kelly Y．C．Lam等［14］應(yīng)用RAPD技術(shù)成功的對Cordyceps sinensis進(jìn)行了鑒定。Khush等［22］人應(yīng)用RAPD技術(shù)對Agaricus bisporus進(jìn)行了分類。Hseu等［23］應(yīng)用RAPD技術(shù)區(qū)分了Ganoderma lucidum。Chiu等［24］人的實驗對Lentinula edodes進(jìn)行了分類與鑒定。本研究應(yīng)用拮抗、ITS和RAPD技術(shù)對21株靈芝菌株進(jìn)行分類，結(jié)果表面1和3號菌株在拮抗實驗中沒有表現(xiàn)拮抗反應(yīng)，ITS序列分析其處在GroupⅢ中且相似距離為0．000，在RAPD聚類分析是相似系數(shù)達(dá)到了95%，3種方法結(jié)果一致，兩者有可能源于同一菌株，即同種異名。本實驗對21株靈芝菌株進(jìn)行了初步的分類與鑒定，對它們之間更詳細(xì)具體的分類與鑒定還有待進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯 李山云)

Study on Classification of 21 Strains of Ganoderma by Antagonistic Effect，ITS and RAPD Technology

WANG Jin-feng1，2，LI Jing1，2，I．T．Datti2，3，ZHANG Jian2，3，LIN Zhi-kui2，3，LIN Zhan-xi2*
(1．College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)ujian Fuzhou 350002，China;2．China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology，F(xiàn)ujian Fuzhou 350002，China;3．College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)ujian Fuzhou 350002，China)

To more scientifically classify and identify Ganoderma Strain，genetic diversity analysis were carried out in 21 Ganoderma strains by using antagonistic experiment，ITS sequence analysis and RAPD molecular marker．The result of antagonistic test showed that，most of the strains had different degrees of antagonism，and there was no antagonistic or antagonistic is not very obvious between a few strains．In ITS sequence analysis，21 Ganoderma strains were divided into 3 groups．The results indicated that the genetic distance ranged from 0．000－0．072 and the average distance is 0．039．The genetic distance between No．1(G．68)and No．3(Ga15)was 0．000，which indicated that they have close genetic relationship．The RAPD data indicated that the similarity coefficient between each strain was over 0．83，all the strains were divided into 2 groups，the No．4(867)strain was selected as one group，the other 20 strains were another group．At the level of 0．932，all strains were divided into14 group．The similarity coefficient of No．1(G．68)and No．3(Ga15)exceeded 0．95，which indicated that the two strains maybe synonyms．The results of these three methods are consistent．Therefore，these three methods can be used to identify relative relationships among 21 Ganoderma lucidum strains．

Antagonistic effect;ITS sequence analysis;RAPD technology;Genetic diversity;Affinity

S567．3+1

A

1001－4829(2017)1－0026－08

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．006

2016－02－03

菌草食用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(2014NZ0 002-1);福建省菌草生態(tài)產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(K80ND8002)

王錦鋒(1990－)，男，福建壽寧人，碩士研究生，主要研究生方向為菌草栽培食藥用菌，E-mail:535108335@qq．com，*為通訊作者:林占熺，E-mail:lzxjuncao@163．com。