白菜型冬油菜和春油菜及雜交F1代質外體抗凍蛋白的SDS-PAGE電泳分析

［KH－3D］方園，劉林波，孫萬倉，劉自剛，楊剛，袁金海，馬驪，侯獻飛，王凱音，郭仁迪，陳奇，王治江，劉海卿，錢武，趙艷寧，米超

(甘肅省油菜工程技術研究中心，甘肅省干旱生境作物重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州730070)

白菜型冬油菜和春油菜及雜交F1代質外體抗凍蛋白的SDS-PAGE電泳分析

［KH－*3D］方園，劉林波，孫萬倉*，劉自剛，楊剛，袁金海，馬驪，侯獻飛，王凱音，郭仁迪，陳奇，王治江，劉海卿，錢武，趙艷寧，米超

(甘肅省油菜工程技術研究中心，甘肅省干旱生境作物重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州730070)

為探討質外體抗凍蛋白能否作為冬油菜抗寒評價的一項新指標，本研究利用SDS-PAGE凝膠電泳對白菜型冬油菜‘隴油7號’和‘隴油9號’與優質春油菜Parkland及其雜交F1代質外體抗凍蛋白進行了檢測。結果表明，低溫脅迫前所有單株質外體抗凍蛋白電泳圖譜顏色淺，其含量較低。低溫脅迫后，各單株質外體抗凍蛋白電泳圖譜顏色加深，含量增加，且單株間差異較大。冬性親本和能夠越冬單株質外體抗凍蛋白電泳圖譜顏色深，而春性親本與不能越冬單株的顏色淺。由此說明，質外體抗凍蛋白作為抗寒評價的新指標是可行的，試驗中篩選出的一些抗寒性狀優良的單株，可為冬油菜抗寒品種的選育和改良提供一定的基礎材料和理論依據。

白菜型油菜;雜交一代;抗寒性;質外體;抗凍蛋白;SDS-PAGE電泳

白菜型油菜(Brassica rapa L．)作為油菜三大類型之一，在我國油菜生產和發展中占據著重要地位。其中，白菜型冬油菜與春油菜是我國西北地區主要的油料作物。近年來白菜型強抗寒冬油菜品種的選育和應用，基本解決了北方油菜安全越冬的問題，促進了北方旱寒區冬油菜的發展，產生了巨大的生態效益和經濟效益［1］。但目前生產上應用的冬油菜品種品質都不太理想，芥酸和硫苷含量偏高，迄今，國內外尚未見白菜型冬油菜雙低品種的報道。雜交育種是創造作物新品種最傳統也是最行之有效的方法之一。因此，通過雜交將白菜型春油菜的優良品質引入白菜型冬油菜不乏是解決白菜型冬油菜品質問題的有效途徑。但利用SDS-PAGE法研究白菜型冬、春油菜雜交對其雜交后代質外體抗凍蛋白的表達量差異的影響也未見報道。有學者研究表明植物抗寒性高低與質外體抗凍蛋白的表達量有關［2－3］，所以研究白菜型冬、春油菜雜交后代的非質體抗凍蛋白有助于了解其抗寒性變化，對選育品質優良的白菜型冬油菜具有現實意義。

近年來人們對冬油菜抗寒性的不斷深入研究，已在植物學特性［4－5］、生理生化［6–8］、抗寒基因［9－10］等方面取得了重大突破。冬油菜抗凍蛋白(AFPs)的發現，推進了冬油菜抗寒性研究新進展。1964年抗凍蛋白(AFPs)在黃粉甲幼蟲中第一次被發現后［11］，經過半個世紀的研究，今天人們已經在魚類［12－13］、昆蟲［14－16］、植物［17］、細菌和真菌［18］等多種生物中均發現抗凍蛋白(AFPs)的存在。迄今為止，魚類、昆蟲的AFPs研究已經非常深入和系統，而植物中AFPs的發現比較晚［17，19］。1992年，Griffith等［17］第一次從經低溫鍛煉的能夠忍受細胞外結冰的冬黑麥(Secale cereale)葉片質外體中得到并部分純化了AFPs，開啟了植物抗凍蛋白的研究先河。之后人們在沙冬青(Ammopiptanthus monglicus)［20］、高山植物唐古特紅景天［21］、胡蘿卜(Daucus carota)［22］、珠芽蓼(Polygonumviviparum)［23］和冬小麥［24，26］等許多植物中發現了AFPs，然而一直無冬油菜方面的研究報道。直到2012年，甘肅農業大學油菜遺傳育種實驗室［25］從白菜型冬油菜隴油6號的葉片及根部提取了質外體蛋白，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳發現在33～45 K之間有一條特異性條帶，經質譜分析鑒定，該條帶為β-1-3-葡聚糖酶，這種酶在冬黑麥中已被證明為抗凍蛋白(AFPs)［15］，具有冰晶修飾活性。

本研究以白菜型冬油菜與春油菜的雜交F1代及親本為試驗材料，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較試驗材料各單株質外體中抗凍蛋白β-1-3-葡聚糖酶的差異，并結合各單株的越冬情況來探討抗凍蛋白作為冬油菜抗寒評價的一項新指標的可行性及雜交后代的抗寒性，以期為冬油菜抗寒育種提供基礎材料和理論依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

本試驗所用材料為白菜型冬油菜‘隴油7號’、‘隴油9號’和春油菜Parkland以及冬春雜交F1代，均由甘肅農業大學農學院油菜課題組提供，詳見表1。試驗材料于2014年8月25日播種于蘭州沙井驛試驗點，常規管理。

表1 試驗材料Table 1Tested materials

該試驗設計低溫脅迫前(2014年10月1日，10～23℃)和低溫脅迫后(2014年11月18日，－3～10℃)2個處理，單株提取質外體蛋白，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較降溫前后材料間抗凍蛋白的差異。第2年返青后統計各單株越冬情況。

1．2 試驗方法

1．2．1 油菜質外體蛋白的提取①質外體蛋白提取。a去除油菜葉片枯黃和干死部分，流水沖流10 min，用ddH2O沖洗2遍，每單株取5 g;b濾紙吸干表面水分后，切成1 cm長條，用提取緩沖液浸洗2～3遍;c然后將切成條的葉片放入塑料杯中，加入80～100 mL上述緩沖液，抽真空，一般7～10 min;d倒掉緩沖液，用吸水紙吸去葉片表面溶液后放入30 mL注射器，將注射器放入50 mL離心管，6140 r/ min，4℃，15 min離心，收集離心管底部液體，即為非質體提取物。②非質體提取物提純。a把提取物加入5倍體積的冷丙酮，在－20℃沉淀20 h后，10 000 r/min，4℃，30 min離心，棄去丙酮，沉淀在－20℃揮發丙酮，獲得凍干蛋白樣品;b用巰基乙醇溶解上面凍干蛋白樣品，充分溶解，在10 000 r/min，4℃，15 min離心，取上清液，在－20℃保存備用。

1．2．2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE參考郭堯君等［26］的方法，采用4%濃縮膠和15%的分離膠。上樣量為每孔10～15 μg蛋白，電泳時，濃縮膠電壓為80 V，待溴酚蘭指示劑進入分離膠后電壓調至150 V，開啟冷凝系統，電泳約3 h后指示劑接近前沿，結束電泳取下玻璃板上的凝膠，用ddH20沖洗掉凝膠上的電極緩沖液后，考馬斯亮藍R-250染色1．5 h，脫色過夜。

1．2．3 越冬統計與抗寒性冬前單株掛牌標記，第2年返青后一一統計各單株的越冬情況，安全越冬記為是(Y)，不能越冬記為否(N)，以越冬情況評價抗寒性的優劣。安全越冬的材料記為抗寒性優良，反之，為抗寒性差的材料。

2 結果與分析

2．1 越冬統計

越冬率是植物抗寒性強弱的直觀體現。翌年返青后對試驗中兩個雜交組合材料的越冬情況進行統計，結果列于表2。其中Parkland為白菜型春油菜，于2014年8月25日大田播種后，9月28日現蕾，其在越冬前已經抽薹開花，在進入冬季后被凍死，因此表中無統計數據;而隴油7號和隴油9號抗寒性表現優異，在蘭州沙井驛越冬率分別為87．46%和80．00%。F1代中部分單株未能越冬，抗寒性發生分離，這可能與白菜型油菜自交不親和導致親本自身雜合有關。從統計結果來看，隴油7號與Parkland雜交F1代越冬率為70．59%，高于隴油9號與Parkland雜交F1的61．11%，這與冬性親本的抗寒性表現一致。

表2 親本及雜交F1代越冬統計Table 2Overwintering statistics of parents and their hybrids their first-filial generations

2．2 隴油7和Parkland及其雜交F1代抗凍蛋白檢測

從圖1看出，各單株質外體蛋白條帶很弱，說明質外體中蛋白含量低，有人研究表明該抗凍蛋白是一種低溫脅迫誘導蛋白，降溫前由于不受低溫脅迫反應，質外體蛋白表達量很少。降溫后，從圖2看出所有材料的蛋白條帶顏色加深，并且所有單株都存在β-1-3-葡聚糖酶條帶，但材料間其含量差異較大。其中春性親本Parkland和F1代有些單株的蛋白條帶較隴油7號和其他單株弱，說明低溫脅迫后在春性親本Parkland和F1代某些單株質外體中分泌合成的蛋白量較少，從表2看出未能越冬。另外，在26～33 k之間出現了一條特異條帶，通過查閱文獻，認為冬油菜體內不止含有β-1-3-葡聚糖酶一種抗凍蛋白，應該還含有其它一種或多種新的抗凍蛋白，目前還沒鑒定出來。

圖1 低溫脅迫前隴油7號和Parkland及其雜交后代質外體蛋白電泳圖譜Fig．1SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou7，Parkland and their first-filial generation before low temperature stress

圖2 低溫脅迫后隴油7號和Parkland及其雜交后代質外體蛋白電泳圖譜Fig．2SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou9，Parkland and their first-filial generation after low temperature stress

2．3 隴油9號和Parkland及其雜交F1代抗凍蛋白檢測

在降溫前和降溫后對隴油9號和Parkland及雜交后代的質外體蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，整個變化趨勢與隴油7號和Parkland雜交組合一致。從圖3看出，各單株質外體蛋白條帶很弱。在降溫前，該蛋白沒有被大量表達，但還是少量存在著。降溫后，所有材料質外體蛋白條帶顏色加深(圖4)，材料間差異較大。Parkland與F1代的第3、5、8、9、12和15等單株蛋白條帶較其他材料顏色淺，質外體分泌蛋白較少，未能越冬。另外，通過電泳發現質外體中存在多種與低溫誘導相關的蛋白質。

3 討論與結論

在北印第安那州的一項研究表明抗凍蛋白是一類低溫誘導蛋白質［27］，當抗寒植物受到凍害或低溫脅迫時，為適應生態環境，植物會發生一系列生理變化來適應低溫脅迫，其體內會合成分泌多種蛋白質-低溫誘導蛋白。AFPs是低溫誘導蛋白中的一類，具有冰晶形態效應、熱滯效應(Thermal Hysteresis，TH)、重結晶抑制效應(Recrystallization Inhibition)［28－29］。AFPs的3個特性表明，在低溫下它與冰晶的形成直接相關，因此對植物的保護具有直接性;而其它低溫誘導蛋白間接調節酶或通過信號傳導等一系列溫度適應與AFPs共同來調節植物的抗寒性［30－31］。

本研究中，低溫脅迫前所有材料質外體抗凍蛋白含量很少，低溫脅迫后，其含量迅速增加。另外，在質外體蛋白電泳條帶中出現了許多特異性條帶，它們應是尚未被鑒定的其他低溫誘導蛋白，是否為抗凍蛋白還需要進一步的研究。從各單株的越冬情況來看，能夠越冬單株在低溫脅迫后質外體蛋白含量較不能越冬單株含量高，蛋白電泳圖中條帶顏色深。可見該抗凍蛋白在抵御外界低溫脅迫中起到重要作用，可作為抗寒評價的一項指標。

圖3 低溫脅迫前隴油9號和Parkland及其雜交后代質外體蛋白電泳圖譜Fig．3SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou9，Parkland and their first-filial generation before low temperature stress

圖4 低溫脅迫后隴油9號和Parkland及其雜交后代質外體蛋白電泳圖譜Fig．4SDS-PAGE electrophoretogram of the protein in the apoplast of Longyou9，Parkland and their first-filial generation after low temperature stress

冬油菜的抗寒性是一個非常復雜的生理過程，研究其抗寒性應該將植物學學特征、生理生化、抗凍蛋白和抗寒基因結合起來，制定出一套完整的抗寒指標才能對其抗寒性進行全面的評價和鑒定。通過本研究，根據各試驗材料抗凍蛋白條帶的差異并結合返青后它們的越冬情況，可以篩選出一些具有優良性狀的單株，為白菜型冬油菜抗寒育種提供基礎材料和理論依據。

［1］孫萬倉．北方旱寒區冬油菜栽培技術［M］．北京:中國農業出版社，2013．

［2］王多佳，曾儼，牟永潮，等．高寒地區冬小麥東農冬麥1號抗凍蛋白的研究［J］．麥類作物學報，2009，29(5):823－826．

［3］李巖，龔束芳，楊濤，等．偃麥草冬季非質體蛋白抗凍活性的研究［J］．東北農業大學學報，2008，39(11):28－31．

［4］Sun W C，Wu J Y，Zeng J，et al．Primary evaluation of cold tolerance among eight winter Brassica rapa［J］．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2008，33(S1):151－155．

［5］Yang N N，Sun W C，Liu Z G，et al．Morphological Characters and Physiological Mechanisms of Cold Resistance of Winter Rapeseed in Northern China［J］．Scientia Agricultura Sinica，2014，47(3):452－461．

［6］Pu Y Y，Sun W C．The Relationship between Cold Resistance of Winter Turnip Rape Varieties and its Physiological Characteristics［J］．Molecular Plant Breeding，2010，8(2):335－339．

［7］Shi P H，Sun W C，Zhao C X．Preliminary Study on the Relation of Antioxidant Enzyme Activities at Low Temperature and the Ice Formation in Root Cells of Winter Rapeseed［J］．Acta Botanica Borealioccidentalia Sinica，2013，33(2):329－335．

［8］Zhu H X，Sun W C，Deng bin，et al．Study on Cold Hardiness and Its Physiological and Biochemical Characteristics of Winter Turnip Rape(Brassica campetris)［J］．Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica，2007，16(4):34－38．

［9］Zhang T G，Chang Y，Wang J，et al．Cloning and Expression Analysis of a BnICE1 from Brassica napus L．［J］．Scientia Agricultura Sinica，2013(1):205－214．

［10］Zhang T G，Wang Y Y，Wang J，et al．Cloning and Real-time Expression Analysis of a Novel MAPK Kinase Gene BnMKK2 in Brassica napus［J］．Bulletin of Botanical Research，2012，32(5):578－583．

［11］Bao L L，Hua Z Z，Ren H S．Antifreeze protein and its influence on ice growing［J］．Journal of East China University of Technology，1995，17(2):51－59．

［12］DAVIES P L，HEW C L．Biochemistry of fish antifreeze proteins［J］．The FASEB Journal，1990，4(8):2460–2468．

［13］DEVRIES A L，WOHLSCHLAG D E．Freezing resistance in some Antarctic fishes［J］．Science，1969，163(3871):1073－1075．

［14］GRAETHER S P，KUIPER M J，GAGNé S M，et al．β-Helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect［J］．Nature，2000，406(6793):325－328．

［15］LIOU Y-C，TOCILJ A，DAVIES P L，et al．Mimicry of ice structure by surface hydroxyls and water of a β-helix antifreeze protein［J］．Nature，2000，406(6793):322－324．

［16］Fei Y B，Jiang Y，Zhao S H，et al．Advances in insect antifreeze protein research［J］．Acta Entomologica Sinica，2000，43(1):98－102．

［17］GRIFFITH M，ALA P，YANG D S，et al．Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves［J］．Plant Physiology，1992，100(2):593－596．

［18］BARRETT J．Thermal hysteresis proteins［J］．The international Journal of Biochemistry＆Cell Biology，2001，33(2):105－117．

［19］Lu C F，Wang H．Progress in Study of Plant Antifreeze Proteins［J］．Progress in Biochemistry and Biophysics，1998，25(3):210－216．

［20］Wei L B，Jiang Y，Shu N H，et al．Biological Characterization of Heat_stable Antifreeze Proteins from Leaves of Ammopiptanthus mongolicus［J］．Acta Botanica Sinica，1999，41(8):837－841．

［21］Lu C F，Jian L C．Secretory Antifreeze Proteins Produced in Suspension Culture Cells of Rhodiola algida var．tangutica During Cold Acclimation［J］．Progress in Biochemistry and Biophysics，2000，27 (5):555－559．

［22］WORRALL D，ELIAS L，ASHFORD D，et al．A carrot leucinerich-repeat protein that inhibits ice recrystallization［J］．Science， 1998，282(5386):115－117．

［23］Ji M J，An L Z，Chen T，et al．Isolation and Identification of the Antifreeze Proteins in Polygonum viviparum of Altifrigetic Subnival Plants in the Tianshan Mountains［J］．Journal of Glaciolgy and Geocryology，2001，23(4):342－345．

［24］Guo L H，Tong X R，Wang D B，et al．Study on Separation of Antifreeze Protein from Wheat Seedlings and Its Antioxidant Activity［J］．Journal of Kunming Teachers College，2007，28(4):71－74．

［25］史鵬輝．北方強冬性白菜型冬油菜抗寒機制研究［D］．甘肅農業大學，2012．

［26］郭堯君．蛋白質電泳實驗技術［M］．北京:科學出版社，1999．

［27］URRUTIA M E，DUMAN J G，KNIGHT C A．Plant thermal hysteresis proteins［J］．Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology，1992，1121(1):199－206．

［28］RAYMOND J A，DEVRIES A L．Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1977，74(6):2589－2593．

［29］Yin M A，Fan D M，OTHERS．Antifreeze proteins and their application in plant antifreeze genetic engineering［J］．Acta Botanica Boreali-occidentalia Sinica，2001，21(1):8－13．

［30］THOMASHOW M F．Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance［J］．Plant Physiology，Am Soc Plant Biol，1998，118(1): 1－8．

［31］Li M R，Liu H X，Wang Y R．Advances in Researches on Molecular Biology of Plant Cold Resistance［J］．Journal of Tropical and Subtropical Botany，2000，8(1):70－80．

(責任編輯 陳虹)

SDS-PAGE Electrophoresis Analysis on Apoplast Antifreeze Protein in Winter and Spring Turnip Rape(Brassica rape L．) and Their First-filial Generation

FANG Yuan，LIU Lin-bo，SUN Wan-cang*，LIU Zi-gang，YANG Gang，YUAN Jin-hai，MA Li，HOU Xian-fei，WANG Kai-yin，GUO Ren-di，CHEN Qi，WANG Zhi-jiang，LIU Hai-qing，QIAN Wu，ZHAO Yan-ning，MI Chao
(Campestrisseed Engineering Research Center of Gansu Province，Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences，Improvement and Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Gansu Agricultural University，Gansu Lanzhou 730070，China)

In order to explore a new evaluation of cold resistance and the basis for equality improvement and cold resistance breeding in winter turnip rape(Brassica rapa L．)in the north of China，the apoplast antifreeze proteins in winter turnip rape Longyou7，Longyou9，spring turnip rape Parkland and their first-filial generation were detected by SDS-PAGE．The result showed that the SDS-PAGE electrophoretogram of the apoplastic antifreeze protein in individual plant were lighter before low temperature stress，and its content decrease;And darker after low temperature stress，and its content increased．The SDS-PAGE electrophoretogram of the apoplastic antifreeze protein in winter parents and the individuals which could survive in winter was darker than that of the spring parent and the individuals which could not survive in winter based on the individual overwintering．It was feasible to evaluate cold resistance by apoplast antifreeze protein as new index，and some excellent cold resistance plants were selected，which could provide the basis for equality improvement and cold resistance breeding in winter turnip rape．

Turnip rape(Brassica rapa L．);First-filial generation;Cold resistance;Apoplast;Antifreeze protein; SDS-PAGE electrophoresis

S634．3

A

1001－4829(2017)1－0034－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．007

2016－01－16

國家自然科學基金項目(31460356，31560397，31660 404);農業部產業技術體系項目(CARS-13);國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2015CB150206);國家農業科技成果轉化項目(2014G10000317);“油菜雜種優勢利用技術與強優勢雜交種創制”項目(2016YFD0101300)

方園(1989－)，女，甘肅景泰人，碩士研究生，研究方向作物遺傳育種，E-mail:1032400251@qq．com;*為通訊作者:孫萬倉(1957－)，男，甘肅會寧人，教授，博士，主要從事油菜育種及十字花科種質資源研究，E-mail:18293121851@163．com。