鐵皮石斛黑斑病菌小分子毒素提取及產(chǎn)毒條件優(yōu)化

［KH－3D］孔瓊，袁盛勇，薛春麗，汪正紅，李祥，盧麗蓉，明應(yīng)忠

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自661199)

鐵皮石斛黑斑病菌小分子毒素提取及產(chǎn)毒條件優(yōu)化

［KH－*3D］孔瓊，袁盛勇*，薛春麗，汪正紅，李祥，盧麗蓉，明應(yīng)忠

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自661199)

鐵皮石斛是一種重要的中草藥，隨著人工種植面積的擴(kuò)大和年限延長(zhǎng)，鐵皮石斛上的各種病害隨之而來(lái)，其中由鏈格孢引起的石斛黑斑病日趨嚴(yán)重。本研究選取鐵皮石斛黑斑病病原—細(xì)極鏈格孢為供試菌株，采用不同溶劑提取病原小分子毒素，同時(shí)對(duì)病原小分子毒素的產(chǎn)毒條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，乙酸乙酯的萃取效果最好，且小分子毒素的活性成分主要存在于水相中;當(dāng)培養(yǎng)基為PSK培養(yǎng)液，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，L∶D=12∶12的培養(yǎng)方式全振蕩培養(yǎng)7 d時(shí)，該病原的小分子毒素活性最強(qiáng)。

鐵皮石斛;黑斑病;小分子毒素

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是一種重要的藥用石斛，富含生物堿、多糖、氨基酸等，在抗腫瘤、降血糖及治療白內(nèi)障和腸胃疾病等具有良好療效［1－3］。隨著人們對(duì)其價(jià)值的不斷認(rèn)識(shí)和開發(fā)，中草藥市場(chǎng)對(duì)鐵皮石斛鮮條和干品的需求也不斷增加，該藥用植物已經(jīng)由野生變?yōu)槿斯しN植［4－5］。隨著種植面積逐年擴(kuò)大和年限延長(zhǎng)，各種病害也隨之而來(lái)，如炭疽病、疫病、黑斑病、莖基腐病、根腐病等均有發(fā)生［6］。據(jù)筆者2012年在屏邊鐵皮石斛種植基地田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)由鏈格孢引起的鐵皮石斛黑斑病日趨嚴(yán)重，該病是栽培生產(chǎn)中常見的主要病害之一，全年均有發(fā)生，平均發(fā)病率在20%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)到70%以上。

植物病原真菌導(dǎo)致寄主發(fā)病的主要因素是通過(guò)病原孢子或菌絲的機(jī)械壓力侵入寄主;或于侵染過(guò)程中產(chǎn)生角質(zhì)酶或細(xì)胞壁降解酶等分解植物組織并侵入;或病原物分泌產(chǎn)生的毒素等。其中毒素是植物病原代謝過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，能在低濃度下干擾植物正常生理功能［7］，包括了大分子毒素和小分子毒素兩類。大量研究表明，鏈格孢屬真菌代謝產(chǎn)生的小分子毒素對(duì)寄主植物具有致病性，如細(xì)交鏈格孢酮酸、鏈格孢酚酸、鏈格孢酚及AAL-毒素等［8－10］，同時(shí)這些代謝產(chǎn)物還會(huì)殘留于植物體內(nèi)，人類食用后具有誘變和致癌作用［11］。因此關(guān)于鐵皮石斛黑斑病病原及其致病機(jī)理和殘留分析的研究迫在眉睫。

基于鐵皮石斛種植生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，筆者于屏邊鐵皮石斛種植基地采集鐵皮石斛黑斑病標(biāo)樣并進(jìn)行室內(nèi)分離鑒定為細(xì)極鏈格孢(Alternaria tenuissima)，前期研究發(fā)現(xiàn)該病原代謝產(chǎn)生的小分子毒素對(duì)鐵皮石斛葉片具有致病性，因此本文章想探明小分子毒素提取的最佳有機(jī)溶劑，同時(shí)對(duì)產(chǎn)毒條件進(jìn)行優(yōu)化，為鏈格孢引起的鐵皮石斛黑斑病致病機(jī)理和抗病品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料及試劑

選取鐵皮石斛黑斑病病原菌—細(xì)極鏈格孢(Alternaria tenuissima)(編號(hào)為SA2)為供試菌種;采用鐵皮石斛組培苗(壯苗生根培養(yǎng)3個(gè)月)離體葉片進(jìn)行毒素活性測(cè)定。試驗(yàn)中所用的丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲苯、正丁醇、乙醇等試劑均為分析純購(gòu)買于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。液體培養(yǎng)基的配方為PD、Czapek、PSK、改良Fries和Richard培養(yǎng)液［12］。

1．2 方法

1．2．1 菌種培養(yǎng)將分離純化后的供試菌于PCA固體培養(yǎng)基上于25℃，光周期為(L∶D=12∶12)培養(yǎng)6 d用于下列試驗(yàn)。

1．2．2 鏈格孢小分子毒素提取及毒素活性測(cè)定取直徑為4 mm菌絲塊接種于250 mL PSK液體培養(yǎng)基(每瓶接種3塊)中，培養(yǎng)7 d(25℃，L∶D=12∶12，振蕩120 r/min)后，用抽濾瓶獲得濾液。在培養(yǎng)濾液中分別加入等體積具有不同極性的有機(jī)溶劑，并于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0 min，靜止萃取直至分層后移出有機(jī)相，并對(duì)水相進(jìn)行萃取，連續(xù)3次收集合并有機(jī)溶劑相，同時(shí)保留水相，并對(duì)兩相進(jìn)行減壓蒸發(fā)［10］。然后將濃縮物復(fù)溶于無(wú)菌水中，稀釋至5 mL后進(jìn)行毒素活性測(cè)定。

毒素活性測(cè)定采用離體葉片針刺法進(jìn)行，即用1 mL無(wú)菌注射器針刺傷鐵皮石斛葉片，后將葉片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿(含有無(wú)菌潤(rùn)濕的拱形濾紙)中，于傷口處滴加20 μl毒素溶液，于25℃光照培養(yǎng)箱中(L∶D=12∶12)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，每天觀察癥狀表現(xiàn)，病斑于第5天觀察和測(cè)量。

1．2．3 產(chǎn)毒條件優(yōu)化取直徑為4 mm菌絲塊分別接種于PD、Czapek、PSK、改良Fries和Richard液體培養(yǎng)基中(每瓶250 mL培養(yǎng)液接3塊，重復(fù)3次)，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min振蕩培養(yǎng)箱中(25℃，L∶D=12∶12)培養(yǎng)7 d，通過(guò)抽濾瓶抽濾后獲得無(wú)菌濾液，然后加入與濾液等體積的最佳提取試劑(1．2．2中得到的結(jié)果)進(jìn)行萃取，方法見1．2．2。根據(jù)毒素的活性強(qiáng)弱(病斑大小)，篩選出最佳培養(yǎng)液。

培養(yǎng)時(shí)間篩選:采用最佳的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置為5、7、10、15、20、25 d時(shí)間梯度，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min、溫度為25℃，光照為L(zhǎng)∶D=12∶12的振蕩培養(yǎng)箱上進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)液提取小分子毒素，測(cè)定其毒性的強(qiáng)弱。

培養(yǎng)溫度篩選:根據(jù)上述獲得的最佳液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間，設(shè)置不同梯度溫度(15、20、25、30、35℃)，于轉(zhuǎn)速為120 r/min、光照為L(zhǎng)∶D=12∶12的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)后分別提取小分子毒素，同時(shí)稱菌絲干重，并測(cè)定毒素活性強(qiáng)弱。

表1 不同有機(jī)溶劑萃取物的外觀性狀及生物活性Table 1Biological activities and appearance characters of extracts from different organic solvents

2 結(jié)果與分析

2．1 不同溶劑提取物外觀性狀及活性

細(xì)極鏈格孢的濾液用甲苯、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮有機(jī)溶劑進(jìn)行小分子毒素萃取，不同溶劑其萃取分層速度不同，其毒性差異較大，具體見表1。根據(jù)萃取后液體的分層速度快慢分為分層快和分層慢，一般分層時(shí)間﹤5 min為分層快，而﹥25 min為分層慢。通過(guò)對(duì)提取后有機(jī)相和水相的毒素活性比較，發(fā)現(xiàn)5種有機(jī)溶劑提取物中活性物質(zhì)主要存在于水相;其中丙酮與乙酸乙酯的萃取效果最佳，且二者處理后的毒素活性差異不大;其次是氯仿和正丁醇;甲苯提取效果最差。但由于丙酮易揮發(fā)，不分層，因此最佳的提取溶劑為乙酸乙酯。

2．2 產(chǎn)毒條件優(yōu)化

2．2．1 培養(yǎng)基篩選在供試5種培養(yǎng)液中，經(jīng)PSK培養(yǎng)液培養(yǎng)的小分子毒素活性最強(qiáng)(表2)，其病斑最大顯著高于其他處理(P＜0．05)，此時(shí)菌絲干重增長(zhǎng)量也達(dá)最大;其次為Richard、PD及Czapek培養(yǎng)液的處理，但三者間差異不顯著;毒素活性最小的培養(yǎng)液為改良Fries，菌絲干重最小，顯著低于其他處理(P＜0．05)。因此，細(xì)極鏈格孢小分子毒素活性的最佳培養(yǎng)液為PSK培養(yǎng)液。

表2 不同培養(yǎng)液對(duì)細(xì)極鏈格孢小分子毒素活性及菌絲生長(zhǎng)的影響Table 2Effect of different liquids on pathogenic activity of small molecule toxins and mycelial growth of Alternaria tenuissima

2．2．2 培養(yǎng)時(shí)間篩選選用最佳培養(yǎng)液，在不同培養(yǎng)時(shí)間下，鐵皮石斛黑斑病病原菌絲生長(zhǎng)量和毒素活性存在較大差異，病原菌的小分子毒素活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先升后降，具體見表3。在6個(gè)培養(yǎng)時(shí)間下，當(dāng)菌絲塊振蕩培養(yǎng)7 d時(shí)，小分子毒素活性最強(qiáng)，病斑最大極顯著高于其它處理(P＜0．01);其次是10 d處理后的毒素，病斑為(3．13±0．09) mm顯著高于其他處理，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)量適中。因此，細(xì)極鏈格孢小分子毒素的最佳培養(yǎng)時(shí)間為7 d。2．2．3培養(yǎng)溫度篩選采用上述篩選出的最佳培養(yǎng)條件，5種溫度處理后的細(xì)極鏈格孢小分子毒素都有一定活性，其致病所形成的病斑大小存在顯著差異(表4)。其中25℃培養(yǎng)下，病原菌產(chǎn)生的小分子毒素活性最強(qiáng)，病斑最大為(4．07±0．12)mm，極顯著高于其它處理(P＜0．01)，此時(shí)菌絲干重也達(dá)到最大，菌絲干重為(14．00±0．58)mg。而在15℃時(shí)病斑最小，菌絲干重最小，但與35℃處理的差異不顯著，說(shuō)明溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于細(xì)極鏈格孢小分子毒素的生成和菌絲生長(zhǎng)。因此，病原菌的最佳產(chǎn)毒溫度為25℃。

表3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)極鏈格孢小分子毒素活性及菌絲干重的影響Table 3Effect of cultural times on pathogenic activity of small molecule toxins and dry weight of hypha of Alternaria tenuissima

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)不同有機(jī)溶劑提取后的植物病原真菌小分子毒素活性存在較大差異，萃取效果與有機(jī)溶劑的極性強(qiáng)弱有關(guān)，極性弱的有機(jī)溶劑萃取效果差，如甲苯、氯仿(兩者的介電常數(shù)e＜4．8)等;而極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑萃取效果好，如正丁醇(e=17．5)、乙酸乙酯(e=6)、丙酮(e=20．7)等，且致病成分主要存在于水相中［10］。文章的研究結(jié)論與前人的結(jié)果相一致，且鐵皮石斛細(xì)極鏈格孢小分子毒素的提取最佳有機(jī)溶劑是乙酸乙酯，同時(shí)該種試劑也適合于鏈格孢菌(Alternaria alternata)毒素提?。?4－15］。

表4 培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)極鏈格孢小分子毒素活性及菌絲干重的影響Table 4Effect of cultural temperatures on pathogenic activity of small molecule toxins and dry weight of hypha of Alternaria tenuissima

大量研究表明，植物病原真菌體外代謝產(chǎn)生的毒素量及活性強(qiáng)弱受供試菌株、培養(yǎng)基成分和外界環(huán)境條件的影響較大。本研究中發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛黑斑病病原細(xì)極鏈格孢在PSK液體培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)毒素均顯著高于其他4種液體培養(yǎng)基，這與紅豆草黑腐病菌(Alternaria tenuissima)［9］和紫莖澤蘭鏈格孢菌(Alternaria alternata)［16］產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)基相一致。其次適合產(chǎn)毒的培養(yǎng)溫度為25℃，相同的結(jié)果也在百日草鏈格孢菌(Alternaria zinniae)［17］的產(chǎn)毒培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn);但紅豆草黑腐病菌其菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的最佳溫度不一致，高溫(25℃)有利于菌絲的生長(zhǎng)，而低溫(15℃)有利于毒素的產(chǎn)生［12］。同時(shí)培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響產(chǎn)毒的效果，本試驗(yàn)中適合鐵皮石斛黑斑病菌(Alternaria tenuissima)產(chǎn)毒的培養(yǎng)時(shí)間為7 d，而小麥黑胚病菌(Alternaria alternata)產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)時(shí)間為13～15 d［18］，紅豆草黑腐病菌為13 d［12］。

本試驗(yàn)研究結(jié)果與前人研究結(jié)果存在著一定的差異，這可能是由于菌種或寄主植物不同造成的。因此有必要對(duì)不同地理分布或致病性差異較大的分離菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究，這不僅是鐵皮石斛進(jìn)行抗黑斑病的抗性材料鑒定的基礎(chǔ)，也是研究病原菌致病機(jī)理的基礎(chǔ)，可以弄清該菌是否存在生理小種。

［1］陸中華，吳學(xué)莉，王慧中．鐵皮石斛壯苗快繁體系的優(yōu)化研究［J］．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27(3):380－386．

［2］封毅，黃茂康，葉建保，等．鐵皮石斛提高小鼠運(yùn)動(dòng)能力、抗疲勞能力和免疫水平的量效關(guān)系分析［J］．南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45(6):1089－1093．

［3］劉莉，王家金，徐蕾，等．鐵皮石斛不同居群的農(nóng)藝性狀與化學(xué)成分的多樣性研究［J］．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，29(2):240－247．

［4］曹漢才，莫俊杰，梁鉀賢，等．有機(jī)肥料對(duì)大棚種植鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(14):177－178．

［5］庾韋花，蒙平，張向軍，等．鐵皮石斛以芽繁芽離體培養(yǎng)技術(shù)體系的建立［J］．南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45(10):1831－1836．

［6］盧振輝，李明焱，王偉杰，等．鐵皮石斛主要病蟲害及其非化學(xué)農(nóng)藥防治［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57(1):123－126．

［7］陳捷．現(xiàn)代植物病理學(xué)研究方法［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007:197．

［8］史文景．柑橘和果汁中鏈格孢霉毒素檢測(cè)技術(shù)研究［D］．重慶:西南大學(xué)，2014．

［9］吳春生，馬良，江濤，等．鏈格孢霉毒素細(xì)交鏈格孢菌酮酸的研究進(jìn)展［J］．食品科學(xué)，2014，35(19):295－301．

［10］康子騰，姜黎明，羅義勇，等．植物病原鏈格孢屬真菌的致病機(jī)制研究進(jìn)展［J］．生命科學(xué)，2013，25(9):908－914．

［11］Pavón Moreno M，González AI，Martín dSR，et al．The Importance of Genus Alternaria in Mycotoxins Production and Human Diseases［J］．Nutr Hosp．，2012，27(6):1772－1781．

［12］郭霞．紅豆草黑腐病菌毒素的研究［D］．蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009．

［13］劉亞光．大豆灰斑病菌毒素組分、致病性及其誘導(dǎo)抗性的研究［D］．哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002．

［14］周兵，彭峰，閆小紅，等．鏈格孢菌對(duì)空心蓮子草致病性的研究［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(4):113－116．

［15］萬(wàn)佐璽．鏈格孢菌粗毒素的提取方法和穩(wěn)定性的研究［J］．湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，20(4):26－28．

［16］萬(wàn)佐璽，周光來(lái)，強(qiáng)勝．鏈格孢菌產(chǎn)毒菌株及產(chǎn)毒培養(yǎng)基的篩選［J］．湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，19(4):7－10．

［17］李榮金，強(qiáng)勝．百日草鏈格孢菌粗毒素的生產(chǎn)、提取及穩(wěn)定性的研究［J］．中國(guó)生物工程雜志，2006，26(8):67－71．

［18］周慧，郜瑞敏，孫炳劍，等．小麥黑胚病菌鏈格孢產(chǎn)毒培養(yǎng)條件及其毒素的致病力測(cè)定［J］．河南科學(xué)，2008，26(3):294－297．

(責(zé)任編輯 王家銀)

Extraction and Cultural Optimization of Small Molecule Toxins of Pathogen Causing Black Spot Disease from Dendrobium officinale

KONG Qiong，YUAN Sheng-yong*，XUE Chun-li，WANG Zheng-hong，LI Xiang，LU Li-rong，MING Ying-zhong
(College of Life Science and Technology，Key Laboratory of High Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province，Honghe University，Yunnan Mengzi 661199，China)

Dendrobium officinale was a precious traditional Chinese herb．The various diseases affected growth of Dendrobium officinale with growing areas and ages，of which the black spot disease caused by Alternaria tenuissima was more and more serious．The extraction reagents and production conditions of small molecular toxins of A．tenuissima in black spot disease were studied in this paper．The results showed that the best extraction reagents was ethyl acetate，and the active ingredient of toxin was mainly in aqueous phase，the optimal cultural conditions were PSK liquid medium，25℃，7 day in 120 r/min with photoperiods of L∶D=12∶12，respectively．

Dendrobium officinale;Black spot disease;Small molecule toxins

S567

A

1001－4829(2017)1－0118－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．021

2015－03－15

紅河學(xué)院校級(jí)委托項(xiàng)目(13WT001);紅河學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(14bs14);紅河學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(SZ1319);紅河學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(DCXL1305);紅河學(xué)院碩士點(diǎn)植物保護(hù)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

孔瓊(1976－)女，云南宣威人，副教授，博士，從事植物病理學(xué)研究，E-mail:kq_biology2@126．com，*為通訊作者，E-mail:ysy9069@163．com。