莖瘤芥(榨菜)抽薹性狀相關SSR分子標記的篩選

［KH－*3D］沈進娟，楊仕偉，劉雪姣，冉廣葵，于曉虎，曾勝，張召榮，朱學棟

(重慶市渝東南農業科學院，重慶涪陵408099)

莖瘤芥(榨菜)抽薹性狀相關SSR分子標記的篩選

［KH－*3D］沈進娟，楊仕偉，劉雪姣，冉廣葵，于曉虎，曾勝，張召榮，朱學棟

(重慶市渝東南農業科學院，重慶涪陵408099)

莖瘤芥先期抽薹給榨菜產量帶來極大損失，是當前影響榨菜產業快速健康發展的主要因素之一。本研究采用莖瘤芥極早抽薹材料‘92’和極晚抽薹材料‘203’配制雜交組合，自交獲得F2代群體，根據集團分離分析法，運用600對蕓薹屬SSR共有引物，進行莖瘤芥抽薹性狀基因連鎖的分子標記篩選。最終得到1個SSR標記Ol12-D09在早抽薹基因池中擴增出特征條帶，而晚抽薹基因池中無特征條帶，經F2代單株驗證發現與莖瘤芥早抽薹基因緊密連鎖，根據Kosambi函數估算其連鎖距離為10．9 cM。本研究結果篩選的SSR標記可用于莖瘤芥先期抽薹的分子標記輔助育種，并為莖瘤芥耐抽薹品種的選育提供理論依據。

莖瘤芥;抽薹;集團分離分析法;SSR標記

莖瘤芥(Brassica juncea var．tumida Tsen＆Lee)又稱榨菜，俗稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬芥菜(B．juncea juncea Coss．)種的一個變種。榨菜是我國長江流域特別是重慶市的特產蔬菜之一。大面積生產上推廣的榨菜品種熟性較為集中，一般9月中旬播種，次年2月上中旬收獲，若遇“暖冬”，“先期抽薹”現象則較為嚴重。近年來，“涪陵青菜頭”以“早”或“晚”的季節差，作為時鮮蔬菜銷售，既提高了產品附加值，又增加了菜農收入，但現有品種不能滿足生產上的早播早收或晚播晚收，否則極易出現先期抽薹或產量不高，空心嚴重，菜形較差，這也是鮮銷青菜頭生產大規模開展的技術“瓶頸”。植株抽薹后蔬菜失去了使用價值，大大降低了經濟效益，是當前影響重慶市榨菜產業快速健康發展的主要因素之一，也是新區特別是中高海拔地區引種栽培成功的關鍵因素。

晚抽薹育種一直是十字花科作物的一個重要的育種目標［1］。大白菜［2－3］、甘藍［4－6］、和蘿卜［7－8］等十字花科蔬菜進行抽薹性狀的分子標記篩選、基因定位和輔助育種等研究比較領先，這些研究加快了耐抽薹性育種進程，降低了產量損失。而莖瘤芥先期抽薹研究起步較晚，主要通過栽培技術控制和減少先期抽薹的發生，受環境影響較大，損失無法預測。目前莖瘤芥研究主要集中在新品種選育［9－10］、栽培技術研究［11－13］和加工品質［14］等方面的研究，對分子標記輔助育種鮮有報道，對耐抽薹品種的鑒定和選育比較滯后，引種也帶來較大難度，嚴重影響了莖瘤芥新品種的大面積推廣和應用。

因此深入開展莖瘤芥抽薹性狀相關SSR標記研究，篩選莖瘤芥耐抽薹性品種迫在眉睫，而有關莖瘤芥抽薹基因的SSR標記研究在國內尚未見報道。本研究以莖瘤芥極早抽薹自交系、極晚抽薹自交系以及雜交后代為實驗材料，采用BSA方法和SSR技術篩選與莖瘤芥早抽薹基因緊密連鎖的標記，以期實現榨菜抽薹性狀的分子標記輔助育種。對莖瘤芥耐抽薹性狀的分子遺傳改良具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1．1 材料

以不同熟性莖瘤芥栽培種自交系作為親本，其中極早抽薹品種P1:92;極晚抽薹品種P2:203。P1×P2得到F1，F1經自交獲得F2，以上材料均由重慶市渝東南農業科學院提供。試驗地選擇肥力均勻一致，地勢平坦，植株生長條件均嚴格要求一致。

1．2 方法

1．2．1 材料處理田間觀察F2代材料抽薹性狀，記錄出現較早和較晚抽薹單株;其中，早抽薹親本和F2群體中出現1株抽薹植株時開始記載抽薹日期，以后每隔1 d記載1次數據，直到所有群體抽薹完畢為止，調查標準以花莖伸長5 cm為抽薹開始的標志。用BSA法將目前已經獲得的F2分離群體根據表型分成2組，一組表現目標基因的性狀(早抽薹)的群體，另一組不表現目標基因的性狀(晚抽薹)的群體，從每一組中各隨機選取構成兩極端DNA池的植株個體，形成2個類似近等基因系遺傳組成的對比DNA庫，即早抽薹池和晚抽薹池。

采用CTAB法提取葉片中的基因組DNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙淀顯色進行定量。利用合成的600對引物結合銀染方法對兩親本的擴增條帶進行比較，篩選在兩親本有多態性的引物，然后用在兩親本間有多態性的引物對基因池的擴增條帶進行比較，篩選在兩親本間和兩基因池間有相同多態性的引物。

1．2．2 SSR分析試驗所用SSR引物由上海英俊生物公司合成，分子標記所用試劑及DNA Marker由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。經PCR反應條件和反應程序優化［15］，PCR反應體系為15 μl:1×緩沖液，2．5 μmol/L MgCl2、150 μmol/L dNTP、1 U DNA聚合酶和100 ng DNA模板，所述的引物含量為0．2 μmol/L。PCR反應程序為:95℃預變性5 min，1個循環;95℃預變性40 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，每個循環降1℃，共11個循環;95℃預變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個循環，72℃再延伸5 min;4℃低溫保存。

擴增產物在10%的的變性聚丙烯酞胺凝膠300 V電壓，200 mA電流，進行電泳70～120 min。電泳后放入200 mL含20 mL乙醇、10 mL乙酸的固定液，50 r/min振蕩固定12～15 min;然后用ddH2O洗1次，放入200 mL 0．2%AgNO3溶液中銀染12～15 min;用ddH2O洗2次，倒入200 mL(1．5% NaOH+0．4%甲醛)ddH2O中顯色5～8 min，顯色后可進行拍照。

2 結果與分析

2．1 多態性引物的篩選

根據蕓薹作物網(http://www．brassica．info)公布的十字花科共同引物合成600對引物。結合銀染方法對兩親本的擴增條帶進行比較分析，篩選出63對在兩親本間有多態性的引物，多態率為10．5%。然后用在兩親本間有多態性的引物對早抽薹基因池和晚抽薹基因池的擴增條帶進行進一步篩選，篩選出同時在兩親本間和兩基因池間有相同多態性的引物。

2．2 抽薹性狀的調查

2014年9 月20日同時播種親本P1、P2、F1和F2代抽薹群體，植株定值于重慶市渝東南農業科學院試驗地，每隔1 d調查抽薹植株。將植株從定植到抽薹時間為149～160 d左右視為早抽薹植株，將定植到抽薹開花時間為171～182 d左右視為晚抽薹，其余的為中間型。調查F2單株110株，其中表現早抽薹的單株34株，表現晚抽薹單株22株，中間性狀單株54株。

2．3 連鎖SSR標記的篩選

以莖瘤芥早抽薹材料‘92’和晚抽薹材料‘203＇為親本，將F2代群體根據BSA法建立莖瘤芥早抽薹基因池和晚抽薹基因池，分別隨機選取早抽薹群體和晚抽薹群體的F2代單株各5株，提取DNA后等量混合，組成早抽薹基因池和晚抽薹基因池，用于引物篩選。采用63對有多態性的SSR引物，以構建的兩個基因池為模板進行PCR擴增，PCR產物用10%的聚丙烯酞胺凝膠電泳進行檢測，篩選到1個在親本及早抽薹基因池和晚抽薹基因池間均存在明顯差異的SSR標記(圖1)，在早抽薹基因池中有特征條帶，而在晚抽薹基因池中沒有特征條帶，該引物編號是Ol12-D09，引物序列為正義鏈序列: CGAGCTGAAGTGGATATTCG，反義鏈序列ACTCGCTTTTACCGTCGTC，預測其可能與抽薹性狀存在連鎖關系。

圖1 SSR引物Ol12-D09在親本和抽薹池中的擴增Fig．1Profile of the differentially amplified products from parent materials and the bolting gene pools with SSR marker Ol12-D09

2．4 連鎖SSR標記的驗證

對上述在早抽薹基因池和晚抽薹基因池中篩選到的可能與抽薹性狀連鎖的SSR標記進行雙親驗證(圖1)，結果表明，SSR標記Ol12-D09擴增的特征條帶出現在早抽薹親本材料‘92’中，而親本晚抽薹材料‘203’中沒有，這與基因池之間的差異一致。同時用SSR Ol12-D09標記進行F2代單株驗證，結果顯示，在早抽薹群體中，34株早抽薹單株中有32株存在特征帶(圖2)，而在22株晚抽薹單株中有4株存在特征帶(圖3)，說明該標記與抽薹性狀存在連鎖關系。

2．5 連鎖標記與目標性狀遺傳距離估算

針對與抽薹性狀存在一定連鎖關系的SSR標記Ol12-D09，在本研究的F2代群體中，發生重組的個體數為2+4=6，F2代群體共有56個單株，所以該標記的重組率為6/56=10．7%。根據Kosambi函數(m=251n［(1+2r)/(1－2r)］，m為遺傳距離，r為重組率)［2］，上述篩選獲得的SSR Ol12-D09標記與早抽薹性狀相關基因的遺傳連鎖距離為10．9 cM。

圖2 SSR引物Ol12-D09對早抽薹基因池中F2代單株基因組DNA的驗證Fig．2Profile of the amplified products from genomic DNAs of individual plant in F2of early bolting gene pools with SSR marker Ol12-D09

圖3 SSR引物Ol12-D09對晚抽薹基因池中F2代單株基因組DNA的驗證Fig．3Profile of the amplified products from genomic DNAs of individual plant in F2of late bolting gene pools with SSR marker Ol12-D09

3 討論

近年來，由于分子標記輔助育種技術自身的優點，不受環境影響，不受時間限制，鑒定結果準確可靠等，已廣泛應用于十字花科蔬菜育種和種質資源材料的鑒定。目前常用的DNA分子標記有SSR［2－3］、AFLP［7－8］、RAPD［4，16］、SCAR［4，7］和ISSR［16－18］等標記，根據選擇材料的差異可以選擇不同的分子標記，可單獨使用，也可聯合使用。其中，SSR分子標記本身具有呈孟德爾式遺傳，共顯性;多態性豐富，穩定性好，重復性高，檢測技術簡便快捷，實驗成本低;對DNA數量及純度要求不高;引物序列公開發表，易于傳播使用等優點［17］。本研究應用SSR進行莖瘤芥抽薹性狀分子標記的篩選，成功篩選到1條與莖瘤芥早抽薹緊密連鎖的分子標記，可用于分子標記輔助育種。張波等［16］研究了與不結球白菜晚抽薹基因緊密連鎖的RAPD、SSR、ISSR、SRAP分子標記，最終僅在SSR引物中篩選到一條引物DBC 16在晚抽薹池中擴增出多態性片段LB，與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5．7 cM;而其他的四種分子標記均沒有找到與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標記。周賢達等［17］研究結果表明芥菜抽薹符合1∶2∶1的遺傳規律，推測芥菜抽薹可能受一個主效基因的控制，應用ISSR標記早抽薹池中篩選到1條引物UBC826，遺傳距離為4．0 cM。芥菜種類多分布廣，不同的芥菜種間差異較大，同一引物也不能適應所有物種，因此，急需篩選出適合莖瘤芥的特異性強的分子標記輔助田間耐抽薹育種。

大量研究結果表明，不同的作物篩選的分子標記不同。有的篩選的分子標記與晚抽薹基因連鎖，徐文玲等［7］運用AFLP分子標記技術，對蘿卜抽薹基因相連鎖的AFLP分子標記進行研究獲得兩個與蘿卜耐抽薹基因相連鎖的AFLP標記，遺傳距離分別為14．6和9．1 cM，并將其中一個標記轉化為簡單易行的SCAR標記，遺傳距離為7．5 cM，可以用于蘿卜育種的分子標記輔助育種。有的篩選的分子標記與早抽薹基因連鎖，這與本研究結果一致，饒立兵等［2］根據集團分離分析法，進行大白菜晚抽薹性狀基因相連鎖的分子標記研究，得到了1個SSR標記‘BRMS-026’與大白菜早抽薹基因緊密連鎖，連鎖距離為7．2 cM，可用于輔助選育大白菜耐抽薹品種。冒維維等［18］應用ISSR和SRAP標記進行了菜薹抽薹性分子標記篩選及定位研究，篩選到四個引物均與早抽薹基因相連鎖，且標記E13M4最近，遺傳距離為16．8 cM，這為菜薹抽薹基因的定位和分子標記輔助育種奠定了初步基礎。無論是與早抽薹基因連鎖還是與晚抽薹基因連鎖，均能把不同抽薹性狀的材料較好地分離開，為分子標記輔助育種奠定了基礎。

目前利用其他的遺傳連鎖標記轉化成連鎖更緊密的分子標記，應用于分子標記輔助育種也有較多報道。其中關于SCAR轉化成功的例子也不少。烏蘭等［4］以與結球甘藍遲抽薹基因連鎖的N 1750為引物，應用RAPD技術進行PCR擴增，檢測到遲抽薹基因，對特異片段進行回收、克隆和測序，依據測序結果設計SCAR引物，經驗證與甘藍遲抽蔓基因連鎖的RAPD標記被成功轉化為SCAR標記，為甘藍分子標記輔助選擇育種提供了基礎。本研究獲得的緊密連鎖分子標記，可以將差異片段進行回收、克隆、測序，設計SCAR引物，有望獲得遺傳距離小于5．0 cM的分子標記，為進一步的基因定位提供參考依據。

4 結論

目前莖瘤芥耐抽薹育種采用傳統方法，工作量大，周期長，而尋找與抽薹緊密連鎖的DNA分子標記可以有效減輕傳統育種手段的工作強度，同時也為抽薹基因的圖位克隆奠定下良好的基礎。芥菜抽薹性狀一般認為主要受一個主效基因的控制［17］，因此使用SSR標記可以尋找到有效的連鎖基因。集團分離分析法，只需要一次雜交，一次自交便可獲得有效的分離群體，相比于近等基因系法需要回交7次以上，省時省力又效率高。但是集團分離分析法對親本要求比較嚴格，本研究選用的極端抽薹的兩個自交系，抽薹性狀可以穩定遺傳，而其他性狀遺傳背景相近，防止了不必要的干擾。本研究通過集團分離分析法獲得的與莖瘤芥早抽薹緊密連鎖的SSR標記遺傳距離為10．9 cM，可以用于莖瘤芥育種的分子標記輔助育種。

［1］黃細松．白菜開花時間相關基因的分子標記及春化相關基因的克隆和表達分析［D］．浙江大學，2006．

［2］饒立兵，胡齊贊，余小林，等．大白菜抽薹性狀相關SSR分子標記的篩選［J］．分子植物育種，2015，13(8):1786－1793．

［3］高穎，羅雙霞，王彥華，等．大白菜抽薹開花時間與SSR和In-Del標記的關聯分析［J］．園藝學報，2012，39(6):1081－1089．

［4］烏蘭，王超．結球甘藍遲抽薹基因RAPD標記轉SCAR標記［J］．分子植物育種，2010，8(2):307－311．

［5］朱洪運，田多成，頡建明，等．結球甘藍抽薹開花時間性狀的QTL定位及分析［J］．華北農學報，2013，28(5):1－5．

［6］曹維榮，王超．甘藍遲抽薹基因的RAPD標記［J］．生物技術通報，2007(5):167－169．

［7］徐文玲，王淑芬，牟晉華，等．蘿卜抽薹基因連鎖的AFLP和SCAR分子標記鑒定［J］．分子植物育種，2009，7(4):743－749．

［8］張美霞，林多．蘿卜抽薹性研究的AFLP體系建立與優化［J］．中國農學通報，2012，28(34):166－171．

［9］胡代文，周光凡，高明泉，等．莖瘤芥新品種涪雜7號的選育［J］．中國蔬菜，2011，20:107－109．

［10］范永紅，周光凡，劉義華，等．豐產型莖瘤芥(榨菜)雜交新品種涪雜5號選育［J］．南方農業，2015，9(28):44－45．

［11］陳竹君，汪炳良，龔蘭，等．光周期與溫度對榨菜發育的影響［J］．浙江農業學報，1997，9(1):11－16．

［12］王培根．秋冬莖用榨菜栽培技術［J］．湖南農業，2015(8):10．

［13］孫光興，周根生，章國榮．榨菜潮豐1號的提純復壯及栽培要點［J］．浙江農業科學，2008(5):526－527．

［14］羅小紅，謝朝懷，劉正川，等．涪陵榨菜種植與深加工技術探究［J］．南方農業，2013，7(2):55－57．

［15］Chen F B，Yang K C，Zhou G F，et al．Analysis of Heterosis，combining ability and genetic diversity in tuber mustard(Brassica juncea var．tumida Tsen＆Lee)inbred lines based on SSR markers and combining ability estimates［J］．PHILIPP AGRIC SCIENTIST，2011，94(2):124－131．

［16］張波．不結球白菜晚抽薹分子標記及抽薹性遺傳分析［D］．碩士學位論文，南京農業大學，2007．1－2．

［17］周賢達．芥菜(Brasscia juncea9 Coss．)抽薹性狀遺傳規律分析及相關基因分子標記研究［D］．西南大學，2010，31－32．

［18］冒維維，高紅勝，薄天岳，等．菜薹抽薹性狀的ISSR和SRAP分析［J］．江蘇農業學報;2009，25(4):829－833．

(責任編輯 李潔)

Selection of SSR Molecular Markers of Bolting in Tumorous Stem Mustard

SHEN Jin-juan，YANG Shi-wei，LIU Xue-jiao，RAN Guang-kui，YU Xiao-hu，ZENG Sheng，ZHANG Zhao-rong，ZHU Xue-dong
(Chongqing Yudongnan Academy of Agricultural Sciences，Chongqing Fuling 408099，China)

The early bolting of tumorous stem mustard caused tremendous loss to mustard production，which became one of the major factors hampering the rapid and healthy development of the mustard industry．In the present study，bulked segregant analysis(BSA)was used to identify the SSR markers related to bolting genes in the F2generation of an early bolting cultivar‘92’and a late bolting cultivar‘203’of tumorous stem mustard．600 pairs of Brassica genus SSR primers were used to identify the polymorphism，and one SSR marker Ol12-D09 was found in the early bolting gene pool，with a close genetic distance of 10．9 cM calculated by the kosambi function．The SSR marker identified in the present study can be used for molecular marker-assisted breeding in the early bolting of tuber mustard．The findings can also provide theoretical foundations for the breeding of bolting-resistant tuber mustard．

Tumorous stem mustard;Bolting;Bulked segregant analysis(BSA);SSR marker

S639．9

A

1001－4829(2017)1－0188－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．032

2016－02－28

重慶市基礎科學與前沿技術研究(一般)項目(cstc2013jcyjA80028);重慶市應用開發(一般)項目(cstc2013yykfA80011);重慶市社會事業與民生保障科技創新專項項目(cstc2015shms-ztzx80005)

沈進娟(1980－)，女，山東日照人，碩士，副研究員，從事芥菜(榨菜)遺傳育種與生物技術研究，E-mail:jinjuanshen @126．com。