hERG鉀通道通過降低氧化應激改善肝細胞糖代謝

盧 晶 沈 涵 程 呈 宋麗妮 張怡塵 謝榮榮 袁明霞 楊金奎*

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室,北京 100730)

·內分泌與代謝病專題 ·

hERG鉀通道通過降低氧化應激改善肝細胞糖代謝

盧 晶1，2沈 涵1，2程 呈1，2宋麗妮1，2張怡塵1，2謝榮榮1，2袁明霞1，2楊金奎1，2*

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室,北京 100730)

目的 研究hERG鉀通道(human ether-α-go-go related gene channels) 在肝細胞中與糖代謝的關系。方法 用hERG鉀通道過表達載體轉染人類肝癌細胞系(liver hepatocellular carcinoma, HepG2)細胞，通過熒光定量PCR (real-time PCR, RT-PCR) 和蛋白印跡 (Western blotting) 法檢測糖代謝、糖異生、氧化應激及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate, NADPH ) 相關亞基的表達。結果hERG鉀通道蛋白可在肝臟細胞中表達，將hERG鉀通道過表達于HepG2細胞后，糖異生相關基因葡萄糖-6-磷酸激酶 (glucose-6-phosphatase, G6Pase) 表達顯著降低，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK) 表達有降低。胰島素表達相關基因葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporter type 2, GLUT2)、胰島素受體底物2 (insulin receptor substrate, IRS-2) 和腺苷酸活化蛋白激酶α亞基2 [(adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase), AMPKα2] 的表達水平均顯著增高。NADPH4種亞基p22、p47、p67和p91表達均顯著降低。結論hERG鉀通道可以通過降低氧化應激改善肝細胞內糖代謝。

人ether-α-go-go相關基因;胰島素抵抗；氧化應激；糖代謝

流行病學研究表明，糖尿病在我國發病人數接近1億，嚴重影響我國人民健康狀況。2型糖尿病主要表現為胰島素分泌缺陷或胰島素分泌障礙[1-2]。肝臟是機體能量代謝的主要器官之一，也是胰島素作用的主要靶器官，參與維持體內空腹血糖濃度。肝臟胰島素抵抗主要是指胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出能力，造成糖異生增加，糖原分解減少，從而導致2型糖尿病。

人ether-a-go-go相關基因 (human ether-a-go-go related gene,hERG) 編碼的離子通道稱為hERG鉀通道，屬于電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channel, Kv) 家族成員[3]。hERG鉀通道主要參與心肌動作電位的復極化，hERG鉀通道突變后可導致外向復極鉀電流降低，QT間隙延長，引起多型性室性心動過速，嚴重者可導致猝死，即長QT綜合征 (long-QT syndrome, LQTs)[4]。 本課題組[5]前期已成功構建hERG鉀通道基因敲除小鼠，并發現hERG鉀通道基因在維持胰島β細胞的形態及功能方面具有重要作用，敲除小鼠表現為血糖水平增高和胰島素分泌降低。氧化應激是造成胰島素抵抗的重要原因之一，hERG鉀通道可能通過抑制氧化應激來改善機體內糖代謝。

本研究擬在細胞水平研究hERG鉀通道在人肝臟細胞HepG2中的表達情況，并深入研究其與氧化應激和糖代謝的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人肝癌細胞系HepG2購自中國協和醫科大學細胞資源中心 (Cell Resource Center, IBMS, CAMS/PUMC)，用DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco公司，美國)進行培養，加入10%(體積分數)胎牛血清(Gibco公司，美國)、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素(Gibco公司，美國)，放于37 ℃，5%(體積分數) CO2孵箱內培養，每2 d用0.25%(質量分數)胰酶(Gibco公司，美國)消化后傳代，待細胞生長至90%時進行質粒轉染。

1.2 質粒構建和轉染

將hERG鉀通道基因構建到pcDNA3.1-GFP-His(-)B (PCDB) (Sino-Geno Max, 中國) 載體上。質粒DNA采用TransIntro EL Transfection Reagent(TransGen Biotech 公司，中國)脂質體轉染法，根據轉染試劑盒操作說明轉染HepG2 細胞。以pcDNA3.1-增強型綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP) 載體轉染的HepG2 細胞作為實驗對照組(control)。細胞轉染48 h后觀察GFP熒光強度并收集細胞用于后續實驗。

1.3 RNA的提取和熒光實時定量PCR

采用天根細胞組織總RNA提取試劑盒(批號：DP419)提取RNA，采用天根FastQuant cDNA第一鏈合成預混試劑(批號：KR108)合成cDNA。Beta-actin基因作為內參。采用Light Cycler 96儀器 (Roche公司，美國)，SYBR Green master mix檢測RNA的表達情況。PCR反應體系為20μL，2×Enzyme mix (Transgen Biotech, 批號：AS111) 10 μL；正向引物 0.4 μL；反向引物 0.4 μL； cDNA 1.5μL， DEPC H2O 7.7 μL。擴增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環；72 ℃ 5 min，自然冷卻至室溫，所用引物見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blotting分析

采用BCA蛋白分析試劑盒 (碧云天生物技術有限公司，中國)測定蛋白濃度。hERG抗體購自Sigma公司(美國)，批號SAB14082；PEPCK購自Santa-Cruz公司(美國)，批號SC-28477；G6Pase購自Santa-Cruz公司(美國)，批號SC-25486；Beta-actin作為內參，抗體購自CST(Cell Signal Technology)公司，批號8457。取80 μg總蛋白進行10%(質量分數)的SDS-PAGE電泳，濕轉(200 mA，120 min)至硝酸纖維膜上。用TBST[TBS+0.1%(體積分數) Tween-20]配制的5%(質量分數)脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，用封閉液將一抗稀釋后與膜在4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌，滴加增強化學發光(enhanced chemiluminescence, ECL)發光液后用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統顯影成像，并用Image J軟件對圖像進行灰度分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1hERG載體轉染HepG2細胞

將hERG過表達質粒和pcDNA3.1-GFP質粒分別轉染HepG2細胞，48 h后觀察GFP表達情況。結果顯示，兩種質粒的GFP熒光均有明顯表達，兩種質粒均成功轉染HepG2細胞(圖1)。

2.2hERG鉀通道在肝臟細胞中表達

采用Western blotting法檢測hERG蛋白在人肝臟細胞HepG2中的表達。結果顯示，hERG蛋白在HepG2中有表達，而將hERG鉀通道蛋白過表達HepG2后，hERG蛋白表達增加明顯 (P<0.01，圖2)。

2.3hERG鉀通道對糖異生相關基因的影響

將hERG鉀通道過表達于HepG2細胞后，檢測糖異生相關基因PEPCK和G6Pase蛋白的表達。Western blotting結果顯示，hERG鉀通道過表達HepG2細胞后，G6Pase蛋白水平顯著降低 (P<0.05)。PEPCK表達水平降低(圖3)。

圖1 質粒轉染HepG2

A：hERGover-expression plasmid； B： pcDNA3. 1-GFP vector；hERG: human ether-a-go-go related gene； Bar: 100 μm.

圖2 hERG鉀通道蛋白在HepG2細胞中的表達

圖3 hERG鉀通道對HepG2細胞糖異生相關基因表達的影響

*P<0.05vscontrol group,n=3；hERG: human ether-a-go-go related gene;G6Pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

2.4hERG鉀通道對糖代謝相關基因表達的影響

將hERG鉀通道過表達于HepG2細胞后，采用RT-PCR方法檢測糖代謝相關基因GLUT2、IRS-2和AMPKα2的表達水平，結果顯示，hERG鉀通道過表達HepG2細胞后，與對照組相比，3種基因的mRNA水平顯著升高 (P<0.05)(圖4)。

圖4 hERG鉀通道對HepG2細胞糖代謝相關基因表達的影響

*P<0.05,***P=0.000vscontrol group,n=3；hERG: human ether-a-go-go related gene;GLUT2:glucose transporter type 2;IRS-2: insulin receptor substrate-2;AMPKα2: adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase α2.

2.4hERG過表達降低NADPH相關亞基的表達水平

為檢測hERG過表達后對NADPH亞基的影響，采用RT-PCR檢測NADPH亞基p22、p47、p67和p91的mRNA表達，結果顯示，hERG過表達后p22、p47、p67和p91的mRNA表達均明顯降低(P<0.05，圖5)。

3 討論

hERG鉀通道屬于電壓依賴性鉀通道家族，但是其電流特點與其他傳統的鉀通道不同，較為復雜[6]。hERG鉀通道在多種組織，如心、腦、垂體、胰腺等均有表達，并發揮不同作用[7]。本課題組[8]前期研究顯示，在C57BL/6小鼠上將hERG基因敲除后，小鼠會出現血糖增高、胰島素抵抗等糖代謝紊亂癥狀現象。肝臟是體內糖代謝的重要器官之一。胰島素抵抗是2型糖尿病發病的機制之一。氧化應激是造成胰島素抵抗的重要原因。目前尚未有研究hERG鉀通道與氧化應激及糖代謝的關系的報道。本研究在細胞水平證實，hERG鉀通道在肝臟細胞中表達，并通過降低氧化應激，減少糖異生，改善糖代謝。

圖5 hERG降低HepG2細胞中NADPH亞基的表達

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group,n=3；hERG: human ether-a-go-go related gene; NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate.

AMPK是一個能量傳感器，參與調節包括胰島B細胞、肝臟、骨骼肌和脂肪在內的多種外周組織的糖脂代謝過程[9]。AMPK是一個異源三聚體蛋白，由α、β和γ 3個亞單位組成，其中α亞基起催化作用。AMPK的亞基α2的活性與胰島素抵抗相關[10-11]。本研究結果顯示，hERG可誘導AMPKα2的表達。糖代謝相關基因GLUT2和IRS-2表達也增高，PEPCK和G6Pase是糖異生的主要限速酶，hERG過表達后，糖異生基因PEPCK和G6Pase表達下降，提示hERG鉀通道在細胞水平可以降低糖異生，促進糖分解。

NADPH氧化酶屬于NOX家族成員，主要由催化亞基p91，跨膜亞基p22，胞質亞基p47、p67等組成的酶復合體。NADPH氧化酶主要的生理學功能是產生ROS，參與機體氧化應激，已有研究[12-13]表明其與胰島素抵抗密切相關。因此本研究推測，hERG鉀通道可能通過抑制氧化應激作用，減少胰島素抵抗從而改善糖代謝。本研究結果證實了這一推測，hERG過表達后，NADPH 4種亞基均有明顯降低，顯示hERG鉀通道通過降低氧化應激水平，調節糖代謝。

本研究下一步擬在兩方面進行深入研究。一方面，在動物水平，利用課題組前期構建的hERG敲除小鼠，研究hERG鉀通道敲除后，主要是肝臟內，氧化應激是否增加從而導致糖耐量異常；另一方面，目前已知的多種hERG鉀通道抑制劑，如E4031[14]、多菲利特[15]、西沙比利[3,16]、維拉帕米[17]等，這幾種藥物均在不同程度上影響hERG鉀通道的門控特性，使其改變，造成電流幅度下降甚至完全消失。本課題組將在細胞水平和動物水平分別運用這幾種藥物，研究藥物抑制后hERG鉀通道對氧化應激及糖代謝的影響。

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編輯 慕 萌

Human ether-α-go-go related gene channels improves glucose metabolism via anti-oxidative stress in HepG2 cells

Lu Jing1，2, Sheng Han1，2, Cheng Cheng1，2, Song Lini1，2, Zhang Yichen1，2, Xie Rongrong1，2, Yuan Mingxia1，2, Yang Jinkui1，2*

(1.DepartmentofEndocrinology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofDiabetesResearchandCare,Beijing100730,China)

Objective To evaluate the effect of the new pathway of human ether-α-go-go related gene (hERG) channels on glucose metabolism in hepatic cells. Methods Liver hepatocellular carcinoma (HepG2) cells were transfected withhERGchannels over-expression plasmid DNA. pcDNA3. 1-GFP plasmid was used as a negative control. The expression ofhERG, phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) and glucose-6-phosphatase (G6Pase) were detected by Western blotting. The mRNA level of glucose transporter type 2 (GLUT2), insulin receptor substrate (IRS-2), adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase (AMPKα2), p22, p47, p67 and p91 were observed by real-time PCR(RT-PCR). Results The experiments showed that hERG gene can be expressed in HepG2 cells. Over-expression ofhERGgene in HepG2 cells could down-regulate the expression of PEPCK, G6Pase. while GLUT2, IRS-2, AMPKα2 genes were up-regulated. Over-expression of hERG gene also inhibited the relative mRNA level of p22, p47, p67and p91. ConclusionhERGchannels could be involved in improving glucose metabolism via anti-oxidative effects.

human ether-α-go-go related gene channels; insulin resistance; oxidative stress; glucose metabolism

國家自然科學基金(81370946, 81400824, 81300726)，北京市自然科學基金(7131005)，首都醫科大學附屬北京同仁醫院科研基金 (TRYY-KYJJ-2016-013)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81370946, 81400824, 81300726), Natural Science Foundation of Beijing (7131005) ， Foundation of Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University (TRYY-KYJJ-2016-013).

時間：2017-04-13 20∶07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2007.058.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.003]

R587.1

2017-01-20)

*Corresponding author， E-mail：jinkui.yang@gmail.com