牛欄山酒廠優良釀酒酵母的篩選及鑒定

王勇

（北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

牛欄山酒廠優良釀酒酵母的篩選及鑒定

王勇

（北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

白酒的發酵過程主要是酒精發酵和風味物質形成的過程。在白酒生產中，酒精發酵過程主要是由釀酒酵母通過糖酵解途徑，將發酵中的糖類分解為二氧化碳和酒精，在生成酒精的同時，釀酒酵母還能夠生成多種有機酸、高級醇及酯類物質，這些物質在基酒的風味中發揮重要作用。優良性狀的釀酒酵母可以起到提高出酒率，增加風味物質含量，節約糧食的目的。牛欄山酒廠針對特定工藝，對大曲及發酵過程中微生物進行分離鑒定，獲得20株釀酒酵母菌，并結合生化性能篩選實驗，最終篩選出產酒精能力、耐酒精能力、發酵力以及發酵產物方面較為優秀的釀酒酵母菌2株，命名為Y006和Y008。將2株釀酒酵母菌分別制作成強化麩曲添加到釀酒生產實驗中，均起到了增加乙酸乙酯，適量控制乳酸乙酯，降低雜醇油含量且提高出酒率的作用。

微生物；產酒精能力；耐酒精能力；釀酒酵母

在白酒生產中，酒精發酵過程主要是由釀酒酵母完成的，優良的釀酒酵母可以起到提高出酒率、改善基酒質量、節約糧食的作用。白酒生產中要求優良的釀酒酵母往往需要具有較強的產酒精能力、較高的耐酒精能力，而且會給成品酒帶來優良的風味[1]。根據以上要求，以牛欄山酒廠生產用大曲和酒醅為材料，分離出釀酒酵母菌20株，并進行了耐酒精能力、產酒精能力以及發酵力和發酵產物等多方面的測定。綜合分析，最終篩選出生化性能優良的釀酒酵母菌2株，并利用其進行麩曲強化添加實驗，取得了良好的實驗效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離純化用培養基

YPD培養基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

1.1.2 TTC培養基

TTC上層培養基：TTC0.5 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g、水1000m L。

TTC下層培養基：YPD瓊脂培養基。

1.1.3 耐酒精性能篩選培養基

含8%vol～30%vol乙醇的8°麥芽汁培養基：試管內裝入10m L滅菌的麥芽汁液體培養基，冷卻后加入無水乙醇制成酒精度為8%vol、10%vol、12%vol……28%vol、30%vol的8°麥芽汁培養基。

1.1.4 高粱糖化液培養基

高粱粉碎后按高粱∶水=1∶8的比例混勻后，90℃水浴下糊化90m in，冷卻到60℃，加入糖化酶，糖化2～3 h，煮沸5m in，雙層紗布過濾，按體積加入30 g/100m L葡萄糖。

1.2 酵母的分離純化及PCR鑒定

1.2.1 酵母菌分離

分別取清香型大曲及入池酒醅1 g，用9m L無菌水稀釋，擬定為10-1的濃度。依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度，分別吸取10-4、10-5稀釋液0.1m L，接種到麥芽汁培養基平板中，用涂布棒均勻涂布。恒溫培養箱中28℃培養3 d，肉眼觀察培養基平板，根據釀酒酵母形態特征，隨機挑選生長形態呈圓形、乳白色、菌落平坦稍凸起、有濕潤感、光滑、邊緣整齊的單菌落接入到新的麥芽汁培養基平板中，28℃培養3 d后觀察菌種是否已純化徹底，若不純則按上述方法重新純化直至出現單一菌種。

1.2.2 釀酒酵母鑒定

挑取少量活化的酵母菌體，于滅過菌的1.5m L離心管內；加入100μL裂解液（100mM Tris，30mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15 Pa滅菌30m in備用）；100℃水浴15m in；加入100μL 2.5M的醋酸鉀溶液，冰浴60m in；4℃下13000 r/m in離心5m in，取上清液200μL至0.5m L離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振蕩10m in，13000 r/m in離心15min，移取100μL上清液至0.5m L離心管中；加入100μL預冷的異丙醇，混勻后于-20℃下放置20m in；13000 r/m in離心15m in，棄上清液；用70%的酒精洗滌沉淀2次；沉淀過夜自然干燥；加入50μL已滅菌的超純水，室溫下溶解1 h，-20℃冰箱儲藏備用。PCR擴增酵母菌D1/D2區，所用引物及PCR條件見表1。

表1 酵母菌D1/D2區擴增引物及PCR反應條件

PCR產物送公司測序后，用Chromas軟件分析測序質量，去除峰圖不可靠的部分對DNA序列進行手動校正，用校正后的序列在NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行同源序列搜索，比較該菌株在D1/D2序列上親緣關系最近的已知酵母菌信息，包括模式菌株與實驗菌株的堿基差異，近緣模式菌株GenBank序列號。目前所有已知酵母菌的核糖體D1/D2和ITS序列都已上傳至數據庫中，可在線搜索。因此，可以根據序列同源性初步判斷待測菌株的分類地位。

表2 釀酒酵母鑒定結果

本實驗中共分離到疑似釀酒酵母35株，通過PCR鑒定后，確定釀酒酵母菌20株，編號為Y001—Y020（見表2）。

2 結果與分析

2.1 酵母的理化篩選實驗方法

2.1.1 酵母TTC顯色實驗

將上述分離出的20株釀酒酵母菌分別接種到TTC顯色培養基中，比較顏色深淺，作為其性能的參考，結果見表3。

結果分析：TTC顯色劑對酵母的代謝產物發生呈色反應，通過它可以判斷酵母中酶活力的大小，即酵母產酒精能力的強弱。產酒精能力強的酵母菌菌落呈深紅色，次之為粉紅色，野生酵母呈紅色或粉紅色，通過TTC顯色實驗結果看出，Y010、Y002、Y008、Y006、Y020為黑紫紅色，顏色最深，初步推斷出是產酒精能力最高的，可作為優良釀酒酵母篩選的參考依據。

表3 酵母菌株TTC顯色實驗

2.1.2 耐酒精性能篩選

將20株釀酒酵母分別接入含8%vol～30%vol乙醇的麥芽汁中，28℃條件下培養60 h，分別在12 h、24 h、48 h和72 h時觀察杜氏小管中的產氣情況，結果見圖1。

圖1 耐酒精度實驗

結果分析：雖然酒精是釀酒酵母的主要產物，但較高的酒精對酵母的生長依然起到一定的抑制作用。而在白酒發酵環境中，酒精的存在是不可避免的，所以具有較高耐酒精能力的釀酒酵母菌才能在發酵過程中生長良好。由耐酒精度實驗柱狀圖可以看出，Y020耐酒精能力最強，達到20%vol，此外Y001、Y006、Y008、Y014也相對較強。

2.1.3 釀酒酵母發酵性能測定

將純化好的釀酒酵母入到帶發酵栓并含有100m L高粱糖化醪的150m L三角瓶中，發酵栓中裝入10m L、5mol/L的硫酸阻止水分蒸發，28℃培養，每日稱重，記錄每日失重情況，待發酵結束時計算總失重，并測定其酒精含量，結果見圖2、圖3。

圖2 菌株發酵失重圖

圖3 菌株產酒精圖

結果分析：通過菌種發酵失重圖和產酒精實驗圖看出，Y006、Y008、Y020這3株酵母在失重實驗和產酒精實驗中數值均較高。

分析總結：通過TTC顯色實驗挑選出顏色最深的5株酵母為Y010、Y002、Y008、Y006、Y020。在耐酒精度實驗中Y020為最高值22%vol，Y008為20%vol，Y001、Y006、Y014介于12%vol和16%vol之間。通過以上生化性能篩選實驗確定Y006、Y008、Y020為初期優良釀酒酵母，將此3株菌種進行代謝產物分析以挑選最優菌株。

2.1.4 酵母產酯能力的測定

酯類是一類具有芳香性氣味的化合物，多數呈果香，是白酒中重要的芳香物質，可在不同程度上賦予酒的香氣，并決定香氣的品質。

將Y006、Y008、Y020分別挑取1～2環加入到100m L麥芽汁液體培養基中，裝好發酵栓，塞緊膠塞，用滴管向發酵栓內加入5mol/L硫酸，直至液面距發酵栓上出氣口1 cm為止。置于28℃培養箱中進行發酵，每天搖勻稱重，直至恒重。將產酯培養后恒重的發酵液轉入500 m L平底燒瓶中，加入100m L、60%vol乙醇進行蒸餾，收集100m L餾分，氣相色譜儀分析測定。選取普遍使用的商業用釀酒酵母作為對照參考，見表4。

表4 酵母代謝產物測定(mg/100 mL)

結果分析：從各菌株所產風味物質來看，主要代謝產物為正丙醇、異戊醇、異丁醇、活性戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯等。在清香型白酒中，乙酸乙酯賦予清香型白酒主體風味，Y006和Y008在產乙酸乙酯方面同對照相比提高了23.84%和30.38%；而影響白酒風味的主要雜醇油為正丙醇、異丁醇、異戊醇等，同對照相比，Y006、Y008產異丁醇分別降低了77.67%和60.57%，產異戊醇分別降低了62.59%和66.27%。由表4可看出，Y006、Y008均起到了增加乙酸乙酯，降低雜醇油的作用。

通過TTC顯色實驗、耐酒精度、菌種發酵失重、產酒精量和產酯產香及雜醇油產量測定，我們將菌株Y006、Y008確定為今后實驗選用的優良釀酒酵母菌。

2.2 麩曲的制作

強化麩曲配方：麩皮65%，水35%，攪拌均勻，裝入三角瓶中，121℃滅菌30m in。

將純化的酵母斜面試管菌種取1環，接種到三角瓶中，28℃培養3 d。取出放入40℃烘干箱中烘干備用。

2.3 強化麩曲添加實驗

將強化麩曲按投糧比例的3‰分別添加到大曲中拌勻，與大曲混合使用，其余按照清茬大曲釀酒工藝。蒸餾后得到的基酒分別稱為Y006基酒、Y008基酒，將不添加強化麩曲的普通工藝的基酒稱為對照基酒[4-5]。分別計算出酒率，并將3種基酒分別降度至60%vol，氣相色譜測定基酒骨架成分，結果見表5。

表5 基酒色譜骨架成分(mg/100 mL)

從表5可以看出，Y006基酒與Y008基酒同對照相比：在總酯和乙酯含量較對照基酒有不同程度提高。乙酸乙酯含量提高11.00%和39.31%，乳酸乙酯降低15.54%和5.55%，正丙醇含量略有上升，而異丁醇和異戊醇含量有較大幅度下降。出酒率見表6。

表6 添加強化麩曲實驗的出酒率

在原糧出酒率方面，添加強化麩曲的出酒率要高于不添加強化麩曲的出酒率，與對照基酒相比，Y006強化麩曲基酒出酒率提高了4.78%，Y008強化麩曲基酒出酒率提高了7.95%。

白酒釀造過程中的酵母主要分為釀酒酵母、產酯酵母以及酵母屬的其他微生物，以牛欄山酒廠生產用清香大曲及酒醅為材料分離出釀酒酵母20株。分別進行了TTC顯色實驗，耐酒精能力、發酵能力和酒精產量的測定。綜合考慮，挑選出Y006、Y008、Y020為初期優良釀酒酵母，隨后對其進行代謝產物分析。與市售商業釀酒酵母相比，Y006、Y008具有高產乙酸乙酯，同時適當降低雜醇油含量的能力，最終將Y006、Y008確定為優秀釀酒酵母菌株，并制作成強化麩曲添加到釀酒實驗中去。從基酒色譜分析及出酒率統計可以看出，添加Y006、Y008釀酒酵母進行強化發酵，有效提高基酒出酒率4.7%～7.9%，每班次全年可增產基酒6.6 t，為企業帶來可觀的經濟效益。同時，通過強化菌種應用可適當提高基酒乙酸乙酯含量，降低乳酸乙酯含量，適量降低雜醇油含量，起到協調酒體，改善酒質的作用，提高了優質酒率。

3 討論

釀酒酵母作為發酵中眾多微生物的一種，在白酒的產酒和產香方面具有重要作用。根據釀酒酵母的理化性能及代謝產物差異，可以簡便有效的篩選出優良菌株，并利用強化麩曲的添加方式進行發酵生產，達到改善基酒質量，提高基酒產量的目的。總體而言，優良的釀酒酵母可以起到提高出酒率和優質酒率，節約糧食，降低原酒成本的作用，在白酒企業中具有較高的應用前景。

[1]沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京：中國輕工業出版社，1998：114-125.

[2]鐘衛鴻.基因工程技術實驗指導[M].北京：化學工業出版社，2007：101-102.

[3]陳紅歌,王明道.基因工程原理與實驗指導[M].北京：中國輕工業出版社，2010：46-58.

[4]王景芝，俞學鋒.酵母生產與應用手冊[M].北京：中國輕工業出版社，2005：94-283.

[5]肖冬光.白酒生產技術[M].北京：化學工業出版社，2005：45-55.

Screening and Identification of Quality S.cerevisiae Strains in Niulanshan Distillery

WANG Yong
(Niulanshan Distillery,Beijing 101301,China)

Liquor fermentation is the process of alcoholic fermentation and the formation of flavoring substances.In alcoholic fermentation,sugar is decomposed into carbon dioxide and alcohol through glycolysis by S.cerevisiae.At the same time,a variety of organic acids,higher alcohols and ester compounds are produced.Those substances play important roles in base liquor flavor.It can be concluded that S.cerevisiae strainsw ith excellentperformance are capable of enhancing liquor yield,increasing flavoring compounds content,and saving grains.In this study,20 S.cerevisiae strains were isolated in Niulanshan Distillery.Through biochem ical property screening test,two S.cerevisiae strainsw ith excellent alcohol-producing capability,alcohohol resistance,fermenting power and fermenting productswere finally obtained and they were named Y006 and Y008.The two strainswere used for the preparation of Fuqu and then used respectively in liquor-making,which could increase ethylacetate,controlethyl lactate properly,reduce fusel oil,and increase liquor yield.

microbe;alcohol-producing capability;alcohol resistance;S.cerevisiae

TS262.3；TS261.1；TS261.4；Q93-3

A

1001-9286（2017）04-0061-04

10.13746/j.njkj.2017048

2017-03-03

王勇(1982-)，碩士，高級工程師，國家級白酒評酒委員。