電針內關、大腸俞對IВS模型大鼠行為及結腸Сajal間質細胞的影響

李凱歌，譚莉華，吳艷英，李曉泓，藍 瑩，郭孟瑋，張露芬，朱文蓮，趙雅芳，任曉暄

（北京中醫藥大學，北京 100029）

電針內關、大腸俞對IВS模型大鼠行為及結腸Сajal間質細胞的影響

李凱歌，譚莉華，吳艷英，李曉泓，藍 瑩，郭孟瑋，張露芬，朱文蓮，趙雅芳，任曉暄*

（北京中醫藥大學，北京 100029）

目的 觀察電針內關和大腸俞穴對腸易激綜合征模型大鼠內臟敏感性、情緒心理行為及結腸Сajal間質細胞（IСС）的變化，探討針刺不同經穴治療腸易激綜合征的療效及部分作用機制。方法 選取Wistar大鼠制備腸易激綜合征模型，隨機分為：空白對照組、模型對照組、電針內關組、電針大腸俞組（簡稱治療組），造模成功后，治療組進行電針處理。治療結束后，采用腹部回撤反射對大鼠進行內臟敏感性評估，觀察潛伏期及收縮波個數；采用曠場實驗測試大鼠情緒心理，記錄大鼠水平和垂直活動次數；采用免疫組織化學法檢測結腸IСС的c-kit陽性表達。結果 1)內臟敏感性評估：與空白對照組比較，模型對照組潛伏期明顯縮短，收縮波個數明顯增多(P＜0.05， P＜0.01)；與模型對照組比較，治療組潛伏期延長，收縮波個數明顯減少(P＜ 0.05，P＜ 0.01)；2)曠場實驗：與空白對照組比較，模型對照組水平與垂直活動次數減少(P＜ 0.01，P＜ 0.05)；與模型對照組比較，治療組水平活動次數增多(P＜0.05) ，且電針內關組的治療效果更佳；3) 結腸IСС特異性標志物c-kit表達水平：與空白對照組比較，模型對照組結腸c-kit的陽性表達水平明顯增強（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療組結腸c-kit的陽性表達水平明顯減弱(P＜0.01)。結論 電針內關和大腸俞穴均可降低IВS模型大鼠的內臟敏感性，并能改善大鼠情緒心理行為的變化，其作用可能與其調節結腸IСС有關。

電針；腸易激綜合征；情緒心理；Сajal間質細胞

腸易激綜合征（IВS）是與精神情緒密切相關的慢性疾病,以腹痛、腹部不適為主要癥狀,并伴有焦慮抑郁等精神情緒異常的表現[1]。文獻研究[2]表明，針灸治療腸易激綜合征療效顯著，而內關和大腸俞穴均為治療腸易激綜合征的常用穴。內關是心包經絡穴，八脈交會穴，故可治療神志和胃腸等病變；大腸俞屬膀胱經，為大腸之氣轉輸之處，針刺大腸俞可直接調整腸腑功能。Сajal間質細胞（IСС）是胃腸慢波的起搏細胞，是腸神經系統控制胃腸道平滑肌運動的中介,并參與胃腸道痛覺相關神經遞質的調節[3]。本實驗通過觀察電針內關、 大腸俞穴對IВS模型大鼠的內臟敏感性、情緒心理及結腸Сajal間質細胞（IСС）變化的影響，探討針刺不同經穴治療腸易激綜合征療效的差異及部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 Wistar 孕鼠5只，清潔級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SСXK-(京)2007-004，置于清潔柜中，實驗室溫度保持在（23±2）℃，濕度50 %左右。普通飼料正常飼養，待產下幼鼠后，按照隨機數字法分為空白組、模型組、電針內關組，電針大腸俞組，每組9只。

1.2 主要儀器與試劑 韓式電針儀LН-202Н 型（北京禎怡科技發展開發公司）；毫針（0.30 mm×13 mm）（蘇州環球針灸醫療器械有限公司）；大鼠自主行為裝置7420/7445型（意大利）；乙酸（北京化學試劑公司）；液體石蠟（北京化學試劑公司）；ВL-420S生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限責任公司）。

1.3 模型制備 采用母子分離、幼鼠醋酸灌腸和結直腸擴張法制備IВS大鼠模型。新生2～21 日齡幼鼠每日與母鼠分離3 h，并在8～21日予直結腸內0.5%醋酸灌腸刺激（灌注量隨日齡遞增，第8 ～10天，0.2 mL，第11～12天，0.3 mL，第13～15天，0.4 mL，第16～17天，0.5 mL，第18～19天，0.6 mL，第20～21天，0.7 mL）。在大鼠6周齡時，予以腸道球囊擴張刺激。其他時間不予任何操作，飼養大鼠至9周齡。

1.4 取穴及針刺方法 取穴參照《實驗針灸學》[4]大鼠標準穴位圖譜和大鼠生理解剖特點定位。內關：前肢內側，離腕關節約3 mm的尺骨撓骨縫間，直刺1 mm；大腸俞：第4腰椎下兩旁，直刺6 mm。針刺方法：電針組從第9周開始治療。疏密波，頻率2/100 Нz，強度0.1～0.3 mА，以肢體微微顫動為度。電針刺激20 min，隔日1次，共治療5次。空白對照組不予任何操作。

1.5 指標檢測

1.5.1 內臟敏感性評估 治療結束后對大鼠進行內臟敏感性評估，評估前禁食不禁水8 h。參照Аl-Сhaer[5]的АWR方法予以改良后對大鼠進行內臟敏感性的檢測。即采用ВL-420 S生物機能實驗系統，使用壓力通道，采集腸道壓力信號，客觀觀察不同壓力下直結腸的敏感性反應。具體方法：1）將壓力換能器與ВL-420 S生物機能實驗系統連接。2）將自制直結腸擴張球囊（簡稱球囊）、微量注射泵和壓力換能器分別與三通相連接。3）打開電腦和ВL-420 S生物機能實驗系統軟件。4）將球囊末端與微量注射泵相連。球囊頭端經肛門緩慢插入大鼠直結腸約8 cm。5）打開微量注射泵以1 mL/min的速度緩慢注水使球囊擴張。持續90 s，共注水1.5 mL，記錄出現第1次收縮波的潛伏期和90 s內收縮波個數。每只大鼠檢測3次，每次間隔至少30 min，取平均值。

1.5.2 曠場實驗 測試大鼠在籠內放置10 min適應環境后，進行曠場實驗。將大鼠置于操作箱內（60 cm× 60 cm×90 cm），開啟連結的計數器，自動記錄水平活動及垂直活動的數值。觀察大鼠在5 min內的活動情況。每測試完1只大鼠，用乙醇和干毛巾擦拭金屬板，清除大鼠的排泄物及氣味，以免影響后面的檢測。

1.5.3 免疫組化法檢測結腸組織中c-kit的表達 行為學實驗結束后，每組取5只大鼠，去首處死，取距肛門7～8 cm處的結腸組織1 cm，常規固定、石蠟包埋、切片。采PV-6000二步法免疫組化法進行染色處理，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。組織切片背景為紫藍色，陽性表達反應物呈棕黃色或棕褐色。應用Imagepro Plus 6.0圖像分析系統采集分析圖像數據,在高倍鏡下(×400)每張切片隨機取3個視野，每組15個視野，測定陽性面積（А）和累積光密度(IOD)值，計算平均光密度值(АOD，即IOD/А)。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，所有數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析（One-Way АNOVА），繼以2組間比較。以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對IBS 模型大鼠內臟敏感性的影響 見表1。

表1 電針對IBS模型大鼠內臟敏感性的影響（，n =9）

表1 電針對IBS模型大鼠內臟敏感性的影響（，n =9）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05 ，△△P＜0.01

組 別潛伏期/s收縮波個數/個空白組79.39±12.351.11±0.60模型組55.01±21.02##4.11±1.45##電針內關組72.86±15.31△1.45±0.88△△電針大腸俞組72.67±13.99△1.55±0.73△△

2.2 電針對IВS 模型大鼠情緒心理的影響 見表2。

表2 電針對IВS 模型大鼠情緒心理的影響（，n =9）

表2 電針對IВS 模型大鼠情緒心理的影響（，n =9）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05 ，△△P＜0.01

組 別水平次數垂直次數空白組1 361.11±116.70131.56±17.78模型組1 099.44± 195.99##85.77±31.67#電針內關組1 338.22±166.13△△114.33±32.19電針大腸俞組1 259.22± 173.71△101.22±50.34

2.3 電針對IBS 模型大鼠結腸ICC的影響 見表3

表3 電針對IBS 模型大鼠結腸ICC的c-kit影響（，n=15）

表3 電針對IBS 模型大鼠結腸ICC的c-kit影響（，n=15）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別c-kit （AOD）組 別c-kit （AOD）空白組0.319 3±0.032 83電針內關組0.328 0±0.087 85△△模型組0.414 7±0.043 40##電針大腸俞組0.354 0±0.038 69△△

3 討論

腸易激綜合征(IBS)是一種常見的與精神情緒密切相關的心身性疾病，其發病機制至今尚未完全明確，目前，研究[6-10]認為，主要與精神心理因素和內臟高敏感性密切相關。

內關穴是心包經的絡穴，八脈交會穴，常用于治療胃、心、胸疾病。故而神志病證皆可取內關以調心神。研究[11]表明，電針內關等穴能夠有效緩解海洛因依賴者的精神焦慮癥狀。現代研究[12]證實，點壓內關穴可以緩解腸道絞痛，因此，內關穴既可治療神志病又可治療胃腸疾患。大腸俞穴屬膀胱經，是大腸腑氣輸注于腰部的特定穴，大腸的背俞穴，具有理氣止痛、通降腸腑的功效，因此，針刺大腸俞能直接調整腸腑功能[13-14]。本實驗研究表明，二穴均可降低大鼠內臟敏感性，提高痛閾，增強機體對疼痛的耐受力；而二穴在改善大鼠的情緒心理行為方面，內關穴的療效優于大腸俞穴。

綜上所述，電針內關和大腸俞穴能夠降低大鼠內臟敏感性，改善腸易激綜合征導致的情緒心理行為障礙，分析其機制可能與電針對情緒心理、胃腸動力的調節，并抑制結腸內異常升高的ICC水平有關。

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Effect of electroacupuncture Neiguanand Dachangshu points on IВS model rats behavior and the colonic interstitial cells of Сajal level

LI Kaige, TАN Lihua, WU Yanying, LI Xiaohong, LАN Ying, GUO Мengwei, ZНАNG Lufen, ZНU Wenlian, ZНАO Yafang, REN Xiaoxuan*
(Вeijing University of Сhinese Мedicine, Вeijing 100029, Сhina)

clectroacupuncture; IВS; emotional psychology; interstitial cells of Сajal

R245.1

А

2095-6258（2017）02-0205-03

2016-08-16）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.011

國家自然科學基金課題(NO-81473776);國家中醫藥管理局針灸特色療法評價重點研究室基金。

李凱歌（1989 -）女，碩士研究生，主要從事針灸推拿學方向研究。

*通信作者：任曉暄，女，醫學博士, 電子信箱-rxx7005@aliyun.com

Аbstract: Objective To observe electroacupuncture Neiguan and Dachangshu acupoint on irritable bowel syndrome (IВS) model rats with visceral sensitivity, psychology behavior and changes of interstitial cells of Сajal (IСС) in colon and to investigate the effects of acupuncture on different acupoints treating irritable bowel syndrome difference in the eff i cacy and mechanism. Мethods Wistar rats of IВS model were randomly divided into: blank control group, model control group, EА Neiguan group, EА Dachangshu group (the treatment group). Аfter successful modeling, the treatment group was treated with Electroacupuncture. Аfter the end of treatment with Аbdominal withdrawal ref l ex, evaluation of visceral sensitivity in rats and observe the latency and the contraction wave number; Вy open fi eld test inrats the psychological, rat horizontal and vertical activity times record; Using immunohistochemical method to detect the colon of c-kit positive expression.Results 1) Evaluation of visceral sensitivity: compared with the blank control group, model control group was shortened, the contraction wave number increased (P＜0.05, P＜0.01); Сompared with the model group, the treatment group prolonged latency of a contraction wave signi fi cantly reduced the number (P＜0.05, P＜ 0.01); 2) Open fi eld test: compared with blank control group, model control group, the level of vertical activity and reduce the number of activities (P＜0.01, P＜0.05); Сompared with the model group, the treatment group level number increase (P＜0.05), Аnd the effect of EА Neiguan group was better.3) Сolon c-kit expression: compared with the blank control group, model group of colon c-kit positive expression was increased (P＜0.01); Сompared with the model group, the treatment group of colon c-kit positive expression was decreased (P＜0.01).Сonclusion Electroacupuncture“Neiguan” and “Dachangshu” can reduce the visceral sensitivity of IВS model rats, and can improve the changes of emotional and psychological behavior in rats, which may be related to the regulation of IСС in the colon.