非小細胞肺癌組織中USP22調控COX?2的研究

楊 健，肖海波 （上海交通大學附屬新華醫院心胸外科，上海200092）

·基礎與轉化醫學·

非小細胞肺癌組織中USP22調控COX?2的研究

楊 健，肖海波 （上海交通大學附屬新華醫院心胸外科，上海200092）

組蛋白的泛素水解酶泛素特異性蛋白酶 22（USP22）是一種表觀遺傳修飾劑，在許多腫瘤中作為致癌基因而上調．USP22在非小細胞肺癌（NSCLC）中異常表達往往預示著患者生存率低下．人類USP22基因作為致癌基因，其調控底物研究較少，在癌癥中作用機制尚不清楚．本研究發現環氧合酶?2（COX?2）作為USP22直接調控底物，其在細胞中的表達水平由USP22介導的去泛素化調控．USP22沉默下調COX?2表達水平，減少其半衰期，并通過泛素化狀態的調控調節COX?2的穩定性與活力，從而抑制肺癌細胞增殖．結果表明USP22可能通過對COX?2的活性和穩定性的調節在癌癥發生發展中起作用．

USP22；COX?2；NSCLC；去泛素化

0 引言

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因，世界上，每年有超過100萬人死于肺癌［1］，非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的80%～90%［2］．目前肺癌的治療方法包括手術切除、鉑類化療、單一放療或聯合治療．然而，肺癌治療及預后較差，總的5年生存率約14%［3］．盡管肺癌在診斷及治療方面取得重大進展，但是其發病率和死亡率在世界范圍內仍然不斷上升［1］．

USP22（ubiquitin?specific protease 22）是一種泛素水解酶，促進組蛋白H2A和H2B去泛素化，在轉錄調控中起重要作用［4］．USP22與Myc的靶基因啟動子區結合并啟動這些基因轉錄，降低USP22表達將導致細胞停滯于G1期［5］．USP22高表達與癌癥遠處轉移和生存率低下有關［6］，并且在 NSCLC、膀胱癌、宮頸癌等疾病中預示預后不良［4，7］．USP22在腫瘤發生、進展中發揮重要作用，其表達對于預測惡性腫瘤的增殖、侵襲轉移和對化療藥物的抵抗將會有很大作用，因此，它被認為是癌癥的生物標記物與治療靶點［8］．

COX是花生四烯酸合成前列腺素（prostaglan?dins，PGs）和血栓素的關鍵酶，其存在兩種不同亞型的同工酶，環氧合酶?1（cyclooxygenase?1，COX?1）和環氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）［9］．前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）是主要的前列腺素類，通過G蛋白偶聯受體發揮作用，與腫瘤生長、免疫抑制和血管生成等有關［10－11］．COX?2在一些腫瘤中過度表達，并且在非小細胞肺癌中預示著生存率低下［12－13］，其表達水平通過泛素／蛋白酶體途徑所調控［14－16］．然而，泛素介導的COX?2表達的具體機制尚不清楚．

本研究發現COX?2作為USP22直接調控底物，其在細胞中的表達水平由USP22介導的去泛素化所調控．結果表明USP22可能通過對COX?2的活性和穩定性的調節而在癌癥發生發展中起作用．

1 材料和方法

1．1 目的質粒和蛋白質的制取pCMV6?XL5質粒載體上USP22基因的cDNA獲自于OrigeneTechnolo?gies公司，以此為模板構建pcDNA3?USP22重組質粒．通過改變SiRNA序列每個密碼子的第三個堿基，構建pcDNA3?USP22?R質粒，其抗USP22?SiRNA 1作用．使用QuikChange誘變試劑盒構建USP22基因的突變體USP22?C185A．pcDNA3載體上克隆有帶Myc標簽的COX?2、COX?1、USP1基因的C端及帶有His標簽的泛素的N端．

1．2 細胞培養人非小細胞肺癌細胞系A549和NCI?H460均保持在DMEM培養液中，培養液中添加10%的胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%青霉素／鏈霉素．放在37℃，5%CO2培養箱中培養．

1．3 USPsiRNA文庫篩選USP siRNA文庫由Dharmacon公司提供，熒光染色siRNA作為對照組（序列為AACGUACGCGGAAUACUUCGA）．A549細胞株在25 nM的siRNA終濃度下進行轉染，持續3 d．

1．4 siRNA轉染取3×105生長狀態良好的A549和NCI?H460細胞培養于10 cm培養基上24 h．取50 μL的脂質體2000加入到1．5 mL的Opti?MEM，在室溫下孵育5 min（溶液A）．然后，取6 μL的siRNA加入1．5 mL的Opti?MEM（溶液B）．將溶液A和溶液B混合并在室溫下孵育20 min．然后在1 mL培養基中加入細胞與混合液，在37℃和5%CO2環境下孵育4 h．COX?2特異性siRNA由Origene提供．

1．5 USP22和USP1體外翻譯USP22和USP1重組蛋白質生成，根據 Promega供應商的指示，使用TNT偶聯轉錄／翻譯系統．反應混合物中含有280 μL的兔網織紅細胞裂解液、8 μL氨基酸混合物，16 μ LTNT反應緩沖液，8 μL T7聚合酶以及4 μg pcDNA3?USP22或pcDNA3?USP1．將混合物混合于400 μL培養基中，在30℃條件下孵育2 h．所獲得的混合物進行免疫共沉淀處理．

1．6 COX?2體外泛素化使用Boston Biochem公司提供的泛素化試劑盒對含有His標簽的COX重組體進行泛素化．泛素共軛體系由200 μg HeLa S?100，5 μM MG?132，4 μM泛素醛，600 μM泛素，和5 μL的能量再生溶液所組成．取1 μg His標記的COX?2與泛素共軛體系在37℃條件下進行培養，持續4 h．泛素化的COX?2根據制造商的指示用Ni?NTA樹脂進行純化．

1．7 免疫印跡對培養的細胞進行裂解，裂解緩沖液由20 μM緩沖液，pH7．5，150 μM NaCl，1%NP40，1 μM EDTA以及由羅氏公司提供的一種完整的蛋白酶抑制劑所組成．提取物在20 kHz條件下每5 s震蕩3次，超聲震蕩處理的細胞在4℃、20 630 g條件下離心30 min，收集上清液．蛋白質濃度由Pierce生物技術公司提供的Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定．約30 μg蛋白用SDS?PADE電泳進行分離，轉印到由Pierce生物技術公司提供的PVDF上．膜在室溫下用5%脫脂奶粉進行封閉30 min，然后室溫下孵育90 min．培養液中包含Novus生物有限公司提供的1∶500 COX?2抗體，Abcam公司提供的1∶500與USP22?C185A交叉反應性抗體（ab4812抗體），1∶500上游遠端元素結合蛋白 1（far upstream element?binding protein 1，FBP1），1∶500 COX?1抗體，1∶1000 β?肌動蛋白以及 Proteintech公司提供1∶500 USP1抗體．用辣根過氧化物酶標記二抗并檢測，使用增強的化學熒光系統進行信號檢測（Santa Cruz生物公司提供sc?2408）．

1．8 免疫沉淀反應在30 μL A／G瓊脂糖凝膠蛋白質柱床體積上添加20 μg Myc抗體，30 μL USP22抗體，或者30 μL對照組抗體，置于200 μL磷酸鹽緩沖液中（PBS），在室溫下孵育60 min．凝膠用PBS洗滌3次，然后置于含0．5 mg細胞裂解液的RIPA緩沖液中，4℃孵育4 h．凝膠用RIPA緩沖液洗滌3次，懸浮于緩沖液中，然后進行免疫印跡分析．

1．9 PGE2酶免疫分析A549細胞加入12孔板，1．5×105／孔，分別加入1．5 nM控制組RNA與80 ng pcDNA3，1．5 nM USP22 SiRNA 1與80 ng pcDNA3，或者1．5 nM USP22 SiRNA 1與80 ng pcDNA3?COX?2，轉染24 h．第二天重復轉染，然后與1 μM的花生四烯酸（Sigma公司提供，貨號10931）在DMEM液中37℃條件下培養15 min，ELISA法檢測PGE2濃度．

1．10 細胞活性檢測使用MTT法檢測細胞活性．COX?2、USP22與對照組轉染細胞接種到96孔板（1×103），并在100 μL培養基中培養72 h．然后每孔加入100 μL MTT試劑（碧云天，貨號C0009），37℃下培養90 min．沉淀物用DMSO溶解，Thermo公司提供的iEMS微孔盤讀取儀560 nm光譜分析．

1．11 數據分析使用SPSS19．0統計學軟件進行數據分析，實驗結果以±s表示，用多樣本均數比較分析方差，P＜0．05表示差異有統計學意義，Origin8．0計算分析COX?2的半衰期．

2 結果

2．1 USP22調節COX?2的表達COX?2是NSCLC生存狀態的預測因子，其水平受泛素蛋白酶體系統調控．本試驗中，USP siRNA轉染A549和NCI?H460細胞，轉染后72 h檢測PGE2的濃度．由于USPs能夠下調COX?2表達，作為NSCLC致癌基因和生存不良預測因子的 USP22，研究 COX?2與 USP22的關系．為驗證siRNA的效果，四種USP22 siRNA和pcDNA3?USP22轉染A549和NCI?H460細胞，對細胞裂解液進行免疫印跡分析．與 control siRNA相比，4種USP22 siRNA沉默USP22表達（圖1A、D），然后檢查 USP22沉默對 COX?2表達及 USP22底物FBP1［17］水平的影響．研究表明與 control siRNA相比，USP22沉默下調A549和NCI?H460細胞中COX?2和FBP1水平（圖1B、E）．為檢測USP22對COX?2的特異性，用USP22 siRNA與編碼耐USP22（USP22R）siRNA的質粒共轉染A549細胞，免疫印跡分析結果表明，USP22R恢復USP22水平，USP22 siRNA下調COX?2表達（圖1C、B）．通過對A549細胞進行control siRNA和USP22 siRNA轉染72 h，檢測USP22基因沉默對COX?2穩定性的影響．免疫印跡分析顯示USP22 siRNA顯著降低COX?2在A549細胞中的半衰期，從2．50±0．57 h降至1．18±0．34 h（圖1G、H，P＜0．05）．USP22異常表達上調COX?2水平，然而無催化活性的c185a USP22突變體表達無影響，證實USP22調節A549細胞中COX?2的穩定性（圖1I）．

圖1 USP22沉默對COX?2表達的影響

2．2 COX?2是USP22底物為檢測USP22和COX?2之間潛在的相互作用，用表達USP22和Myc標記的COX?2載體對A549和NCI?H460細胞進行轉染，細胞裂解液用抗Myc抗體和對照IgG抗體進行免疫沉淀．結果表明USP22與COX?2免疫共沉淀（圖2A、D）．細胞裂解液用抗?USP22抗體進行免疫沉淀，得到相似結果（圖2B、E）．為證實USP22與COX?2之間的直接作用，將重組USP22與His標記的COX?2或者 COX?1孵育，蛋白用親和層析法進行分離．USP22與COX?2同步降低，但與COX?1變化不一致，表明USP22與COX?2之間直接作用（圖2C）．為檢測COX?2是USP22底物，全長度His標記的COX?2泛素化與USP22或無催化活性的USP22 c185a突變體進行孵育，免疫印跡結果表明與USP22共孵育導致COX?2去泛素化，USP22 c185a突變體未出現去泛素化（圖2F）．為證實USP22對COX?2去泛素化特異性，使用一種去泛素化酶，USP1作為對照進行泛素化實驗．含USP22組泛素化的COX?2水平降低，而在USP1或USP22 c185a組泛素化COX?2增加（圖2G）．另外，對細胞裂解液進行COX?2泛素化分析以及使用抗泛素抗體都得到相似結果（圖2G、H）．綜上所述，結果表明 COX?2是 USP22底物，其穩定性受USP22介導的去泛素化調控．

圖2 USP22與COX?2相互關系

2．3 USP22調節COX?2的活性和穩定性及其對細胞增殖的影響為進一步研究 USP22通過調節COX?2如何發揮其在腫瘤發生中的作用，本研究通過siRNA下調A549細胞中USP22和COX?2表達，觀察其細胞活力．USP22 siRNA處理的細胞中，異常表達的COX?2可以恢復細胞內COX?2水平（圖3A）．用MTT法檢測細胞活性，結果表明USP22和COX?2表達下調明顯降低細胞的活力，分別為63%和47%，過度表達的COX?2能夠恢復USP22 siRNA以及過表達COX?2質粒處理細胞的活力（圖 3B）．實驗證明USP22通過COX?2水平的調節影響細胞活力．為明確USP22對COX?2的作用，研究了細胞中炎癥因子PGE2水平．沉默USP22或COX?2明顯減少PGE2的生成，然而過表達COX?2可以恢復被USP22抑制的PGE2水平．這表明USP22調節COX?2的表達和活性（圖3C）．

圖3 沉默USP22抑制細胞增殖，COX?2增加PGE2水平

3 討論

真核細胞中，蛋白質水平需要嚴格調控以保持平衡．泛素蛋白酶體系統是體內蛋白質清除機制之一，在體內發揮諸多作用，如阻止與癌癥發生有關的分子信號通路傳導［18］．去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes，DUBs）催化蛋白質去泛素化，然后分解為半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶．USPs是一個家族成員最多、結構差異最大的去泛素化酶亞家族，至今被認識研究超過60多種［19］．USPS包含三個保守的氨基酸殘基，Cys、His和推測的第三個保守氨基酸殘基Asp或Asn組成催化三聯體，它們是由四面體瞬間結構形成的氧離子洞中間的水分子橋來穩定的．DUBs參與許多生物學過程，他們在人類惡性腫瘤中的作用研究較少［20］．一些DUBs抑制劑已被研究，可望成為潛在抗癌劑．然而，由于USP抑制劑缺乏特異性，并且針對不同的USPs，特異性底物的識別對發展有效的靶向藥物是必不可少，因此其研究應用受到限制［19］．

USP22與各種惡性腫瘤，包括NSCLC的發生發展有關，然而，其在癌癥中的作用機制仍不清楚．本試驗中，發現COX?2作為USP22底物，USP22通過調節COX?2的活性和穩定性發揮其在腫瘤發生發展中的作用．

在本研究中，沉默USP22下調COX?2水平，并降低肺癌細胞A549半衰期．USP22通過泛素化狀態調節COX?2穩定性和活性．COX?2表達的調節作為一種潛在的癌癥治療策略．

實驗報道［12］，長期使用針對COX酶的非甾體類抗炎藥，可以減少肺癌的發病率，據此，COX?2表達的調節可以作為一種潛在的癌癥治療策略．選擇性COX?2抑制劑塞來昔布已被批準用于治療家族性腺瘤性息肉?。袑W者［21］建議塞來昔布可以作為NSCLC化療輔助用藥．然而，COX?2表達上調以及PGE2增加具體作用仍不清楚，COX?2表達上調刺激細胞生長，但也導致細胞周期阻滯，PGE2在一些腫瘤中抑制細胞生長，但也通過激活EGFR增加細胞活力促進生長［22］．COX?2是一種膜結合蛋白，存在于內質網（endoplasmic reticulum，ER）中，通過ER相關的降解系統，將COX?2從內質網轉運到細胞質，然后被UPS調控降解［23］．COP9信號轉導體調控COX?2穩定性，其為一種調控蛋白質穩定性的多亞基復合物，影響其泛素化過程［24］．通過泛素化過程對COX?2水平的調節以及COX?2和PGE2信號通路在肺癌患者中的重要性已被證實．研究結果表明USP22與COX?2水平存在相關關系，然而 USP22上調和COX?2在NSCLC之間的相互關系還需進一步研究．

USP22底物的識別在理解USP22在腫瘤發生發展的作用機制尤其重要，USP22去除組蛋白H2A和H2B泛素部分，并調節 c?myc基因的表達［5，25］．USP22所介導的泛素化修飾組蛋白H2B過程，可以激活JAK?STAT誘導基因，這可能是USP22在癌癥患者中潛在作用機制之一［26］．FBP1為 USP22底物，USP22介導的FBP1去泛素化調節其對靶位點的募集和基因調控表達，這提示USP22可能通過轉錄調節發揮其在腫瘤中的間接作用［17］．USP22與MDMX之間相互作用導致 p53依賴的細胞凋亡［27］．盡管USP22致癌作用已有相關文獻報道，其在一些惡性腫瘤也表達上調，但是USP22底物識別是有限的，其作用機制尚待闡明．目前研究顯示，USP22介導的COX?2去泛素化調控細胞中COX?2和PGE2表達水平，其對肺癌細胞活力的影響提示潛在的致癌機理．USP22沉默對細胞增殖、侵襲和轉移的影響，以及明確COX?2和PGE2軸在USP22所參與的腫瘤中起的作用，還需進一步研究．

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USP22 regulation of cyclooxygenase?2 in non?small cell lung cancer

YANG Jian，XIAO Hai?Bo
Department of Cardiothrocic Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China

Ubiquitin?specific protease 22（USP22）is an epige?netic modifier that is upregulated in many cancers as an oncogene．Abnormal expression of USP22 in non?small cell lung cancer（NSCLC）often indicates a poor survival rate．USP22 gene，as an oncogene，has little research on its regulatory substrate and its mechanism in cancer is unclear．In the study，we found that cyclooxygenase?2（COX?2）as a substrate for direct regulation of USP22，its expression in cells regulated by USP22 mediated ubiquitination．USP22 silencing down regulate the expression of COX?2，reduce its half?life，and regulate the stability and activity of COX?2 through the regulation of ubiquitination，thereby inhibi?ting the proliferation of lung cancer cells．The findings of this study suggest that USP22 may play a role in the development of cancer by regulating the activity and stability of COX?2．

USP22；COX?2；NSCLC；Deubiquitination

R734．2

A

2095?6894（2017）02?16?05

2016－12－21；接受日期：2017－01－05

國家自然科學基金（81572248）

楊 ?。瓻?mail：15800551893＠163．com

肖海波．副主任醫師，副教授．E?mail：xnavor＠163．com