不同劑量ALA-PDT對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖的抑制作用

張 鑫 郝玉琴

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·論著·

不同劑量ALA-PDT對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖的抑制作用

張 鑫1,2郝玉琴1

目的： 確定5-氨基酮戊酸-光動力療法對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞抑制的最佳劑量。方法： 體外培養人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株，應用MTT法檢測不同ALA濃度(0.5、1、2 mmol/L)、不同PDT光照劑量(5、10、20、40 J/cm2)下A431細胞的增殖水平。結果： 當ALA濃度為0.5 mmol/L時，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對A431細胞的抑制率分別為6%、10%、15%、18%；當ALA濃度為1 mmol/L時，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對A431細胞的抑制率分別為30%、52%、80%、82%；當ALA濃度為2 mmol/L時，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對A431細胞的抑制率分別為31%、54%、81%、82%。結論： ALA在濃度為1 mmol/L,光照劑量為20 J/cm2時，ALA-PDT對A431細胞增殖抑制效果達到最佳。

ALA-PDT； 皮膚鱗狀細胞癌； A431細胞； 增殖

皮膚鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)是皮膚癌中常見惡性腫瘤，發病率逐年升高。SCC的治療方法很多，ALA-PDT是繼手術、放療、化療等傳統療法后,近二十年發展起來的新療法,由光敏劑受光活化形成活性氧，進而導致細胞受損甚至死亡,是一種基于光敏劑光毒性反應的新的治療方法[1]。ALA-PDT在臨床治療腫瘤中已取得了令人矚目的成就，ALA-PDT最突出的優勢是準確定位靶組織，可選擇性殺死腫瘤細胞而對鄰近的正常組織影響較小。與手術、化療、放療等傳統治療手段相比，PDT創傷小、毒性低，兼具美容效果[2,3]，在腫瘤治療中具有不可替代的優點。盡管ALA-PDT已在臨床使用，但關于其基礎研究，各學者的實驗研究的作用劑量有很大出入。因此本實驗應用不同濃度ALA、光照劑量來觀察ALA-PDT對鱗癌A431細胞的作用效果，旨在為ALA-PDT用于細胞等基礎研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑 實驗儀器及試劑：ALA為Sigma公司產品；胎牛血清、DMEM高糖培養基、胰酶為Invitrogen公司產品；四甲基偶氮唑藍(MTT)為Sigma公司產品；96孔反應板為德國Roche公司產品；酶標儀為Thermo Labsystems公司產品；紅光光照儀為普門公司產品。

1.2 細胞培養 人A431皮膚鱗癌細胞株(由長沙贏潤生物技術有限公司提供)貼壁培養于DMEM(高糖型)完全培養基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中，置37℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱內培養，每1～2 d換液一次，細胞單層貼壁生長，待長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個細胞，取對數生長期的細胞準備實驗。

1.3 實驗分組 空白對照組:無光敏劑未光照組;光照對照組：僅照光無光敏劑;藥物對照組：僅加藥未光照; ALA-PDT組:不同ALA濃度+不同光照劑量。

1.4 細胞PDT處理 取處于對數生長期、生長狀態良好的A431細胞以每孔104個細胞接種于96孔培養板中，每孔培養基體積200 μL。待A431細胞貼壁24 h后，進行上述干預。ALA的濃度分別為:0、0.5、1、2 mmol/L；ALA避光孵育時間:4 h；光照劑量:紅光儀，波長635 nm，功率密度為18 mW/cm2，光斑距96孔板5 cm處垂直照射，治療光斑完全覆蓋實驗細胞，光照能量密度分別為：5、10、20、40 J/cm2。藥物對照組：ALA 1 mmol/L,嚴格避光。干預后立即更換新鮮培養基繼續培養24 h后進行MTT檢測。每組平行3個復孔，實驗重復3次。

1.5 MTT比色法檢測細胞體外增殖活力 各組細胞在檢測時間點時，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2培養箱中培養4 h，小心吸棄孔內培養上清液，避免吸去紫色結晶。

每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。

選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值OD，記錄結果，以未加藥細胞組作為空白對照組，計算細胞增殖抑制率/存活率，抑制率(IP)=(1-藥物組OD/對照組OD)×100%；存活率=藥物組OD/對照組OD×100%。對照組存活率為100%，

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行處理。所有數據均以均數±標準差表示，采用方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單獨照光及單獨加藥對細胞并無增殖抑制作用。

2.2 不同濃度ALA和不同光照劑量對A431細胞的增殖抑制率影響 見表1，圖1。當ALA濃度為0.5 mmol/L時，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對A431細胞的抑制率分別為6%、10%、15%、18%；當ALA濃度為1 mmol/L時，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2對A431細胞的抑制率分別為30%、52%、80%、82%；當ALA濃度為2 mmol/L時，光照劑量為5、10、20、40 J/cm2，對A431細胞的抑制率分別為31%、54%、81%、82%。

表1 不同濃度ALA和不同光照劑量對A431細胞抑制率影響

注：*與對照組比較P<0.05

圖1 不同濃度ALA和不同光照劑量對A431細胞抑制率影響

2.3 當ALA濃度為1 mmol/L與2 mmol/L對A431細胞抑制作用效果明顯，二者間的作用效果差異不大；A431細胞抑制率隨光照劑量的增加而增加，在20～40 J/cm2內增加不明顯。

3 討論

SCC是皮膚科常見惡性腫瘤，發病率逐漸增高。目前的治療方法包括手術切除(Mohs手術)、冷凍療法 、電灼燒、局部治療(5-氟脲嘧啶和咪喹莫特)、放射治療等。對于大面積、特殊部位(面部、外生殖器)以及多灶性病變的SCC，這些方法療效不佳，而且容易形成疤痕。此外，這些療法所具有的美容效果非常有限，難以滿足人們對良好外觀的要求。PDT是近20年來興起并不斷發展的一項腫瘤治療新技術，在臨床治療腫瘤中已取得了令人矚目的成就，由于皮膚病損組織的照光容易實現，PDT在皮膚科的應用是比較活躍的研究課題[4-6]。PDT作為一種新療法，具有良好的組織選擇性，不破壞正常細胞且不受皮損位置及大小的限制，成為目前臨床治療SCC等增殖性疾病使用越來越多的手段。

ALA-PDT雖然已經應用于臨床，但有關其基礎研究的實驗作用劑量各研究者有很大出入，如喬麗等[7]關于ALA-PDT對皮膚鱗癌A431的增殖研究時采用的ALA為0.4 mg/mL,功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2。劉園園等[8]研究發現ALA濃度為3.2 mmol/L、光照劑量為80 J/cm2時，ALA-PDT對皮膚鱗癌A431細胞的抑制作用達最佳。張秀娟等[9]研究ALA-PDT對人皮膚鱗癌SCL-1細胞的殺傷作用是采用ALA濃度為40 μg/mL，功率密度230 mW/cm2。其中能量密度、功率密度、照光時間是照光的三大參數，三者之間的換算公式：照光時間(S)=能量密度(J/cm2)/功率密度(W/cm2)。

本實驗應用不同濃度ALA、光照劑量來觀察ALA-PDT對鱗狀細胞癌A431細胞的抑制作用，旨在為ALA-PDT用于細胞等基礎研究提供實驗劑量依據。為明確ALA-PDT對人皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖抑制的最佳作用劑量，我們釆用MTT法進行檢測，發現單獨用藥和單獨照光對細胞生長基本無影響。在相同的培養時間和ALA濃度下，隨著光照劑量遞增細胞抑制率呈上升趨勢，但在20～40 J/cm2這兩個光照劑量之間，細胞抑制率上升不明顯，各ALA濃度組在20～40 J/cm2這兩個光照劑量之間，細胞抑制率差異無顯著性(均P>0.05)，殺傷作用進入平臺期。提示并非光照劑量越高對細胞殺傷越強。同時，培養時間和光照劑量相同時，ALA濃度為1 mmol/L、2 mmol/L與ALA濃度為0.5 mmol/L相比，不同光照劑量對A431細胞抑制率差異有顯著性(均P<0.05)，而ALA濃度為1 mmol/L與2 mmol/L時，不同光照劑量對A431細胞生長抑制率差異無顯著性(均P>0.05)。

本實驗結果提示，對于體外培養人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞，ALA在濃度為1 mmol/L,光照劑量為10 J/cm2時，A431細胞抑制率為52%；ALA在濃度為1 mmol/L,光照劑量為20 J/cm2時，A431細胞抑制率為82%，ALA-PDT的殺傷作用最佳。

[1] Darlenski R, Fluhr JW. Photodynamic therapy in dermatology: past, present, and future[J]. J Biomed Opt,2013,18(6):1208.

[2] Lee Y, Baron ED. Photodynamic therapy: current evidence and applications in dermatology[J]. Sem in Cutan Med Surg,2011,30(4):199-209.

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[7] 喬麗,楊志勇,許成山,等.光動力學療法對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖及細胞周期的影響[J].山西醫科大學學報,2016,47(1):51-54.

[8] 劉園園,王逸飛,張春敏,等.ALA-PDT對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞Caspase-3及Caspase-7表達的影響[J].山東大學學報,2014,52(12):50-53.

[9] 張秀娟,焦亞寧,劉建平,等.細胞外信號調節激酶在5-氨基酮戊酸光動力療法殺傷SCL-1細胞中的作用[J].中國皮膚性病學雜志,2013,27(5):435-439.

(收稿：2016-09-05 修回：2016-10-28)

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Inhibition of ALA-PDT on A431 cells in cutaneous squamous cell carcinoma

ZHANGXin1,2,HAOYuqin1.

1.DepartmentofDermatology,theThirdAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China; 2.GraduateStudentinInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohehot010010,ChinaCorrespondingauthor:HAOYuqin,E-mail:haoyuqin0472@163.com

Objective: To determine the optimal dose of ALA-PDT on the inhibition of A431 cells proliferation in cutaneous squamous cell carcinoma. Methods: A431 cells were cultured firstlyinvitro, and then, were treated with different drug concentration (0.5, 1 and 2 mmol/L) and different dose of PDT (5, 10, 20 and 40 J/cm2). The proliferation of treated A431 cells was detected by MTT. Results: The inhibition rates of A431 cells treated under the condition of 0.5 mmol/L ALA combined with 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 6%, 10%, 15% and 18% respectively. The inhibition rates of A431 cells treated with 1 mmol/L ALA combined with PDT of 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 30%, 52%, 80% and 82% respectively. The inhibition rates of A431 cells treated with 2 mmol/L ALA combined with 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 31%, 54%, 81% and 82% respectively. Conclusion: The highest inhibition rate of PDT on A431 cell proliferation is 1mmol/L ALA and 20 J/cm2PDT.

ALA-PDT; cutaneous squamous cell carcinoma; A431 cell; proliferation

內蒙古自治區自然科學基金(編號：2014MS0895)

1內蒙古醫科大學第三附屬醫院(內蒙古包鋼醫院)皮膚科，包頭市，014010

2內蒙古醫科大學在讀研究生，呼和浩特，010000

郝玉琴，E-mail: haoyuqin0472@163.com