平纖寧肺顆粒劑對肺纖維化大鼠肺組織中轉化生長因子β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響

張傳名 茆俊卿 朱琴梅 陳 靜

(1 江蘇省揚州市中醫院，揚州，225002； 2 揚州市職業大學，揚州，225009)

平纖寧肺顆粒劑對肺纖維化大鼠肺組織中轉化生長因子β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響

張傳名1茆俊卿1朱琴梅2陳 靜1

(1 江蘇省揚州市中醫院，揚州，225002； 2 揚州市職業大學，揚州，225009)

目的：觀察平纖寧肺顆粒劑對鹽酸博萊霉素所致大鼠肺纖維化的保護作用。方法：60只SD大鼠，雄性，按體質量隨機分為正常對照組、模型組、平纖寧肺顆粒劑高劑量組、低劑量組，每組15只。鹽酸博萊霉素氣管內注射誘發肺纖維化，造模后給藥，分別在給藥7、14、28 d每組處死5只，取肺臟做組織病理學檢測，同時免疫組化法檢測肺組織內轉化生長因子β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原。結果：模型組大鼠肺組織出現明顯的炎細胞浸潤，纖維結締組織增生，平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組大鼠在第14、28天的病理變化均較同期模型組減輕。模型組大鼠肺組織TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原表達在第7、14、28天均明顯高于同期正常對照組，與正常對照組比較有統計學意義(P<0.01)。平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠表達與同期模型組比較明顯降低，有統計學意義(P<0.05，0.01)。結論：平纖寧肺顆粒劑可以有效減輕肺纖維化，抑制肺組織中TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達。

平纖寧肺顆粒劑；肺纖維化；病理學；轉化生長因子β1；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原

肺纖維化是一種漸進的慢性肺間質疾病，其主要病理特點是早期彌漫性的肺泡炎和后期大量成纖維細胞的病理性增生及基質膠原進行性沉積并取代正常的肺組織結構，大部分患者會在3～8年內死于呼吸衰竭[1-2]。盡管肺纖維化的患者死亡率很高，但是目前還沒有治療該病的有效方法，此病的發病機制及發展進程也不清楚。本研究使用鹽酸博萊霉素(Bleomycin，BLM)制造大鼠肺纖維化模型[3]，觀察平纖寧肺顆粒劑對鹽酸博萊霉素所致大鼠肺纖維化的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，60只，SPF級，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(浙)2014-0001。給藥前后，SD大鼠分籠飼養，每籠5只，喂以全價顆粒鼠飼料(南京協同生物工程有限公司)，自由飲水飲食，室溫20～25 ℃，每天人工光照12 h，室內通風良好，實驗室相對濕度：65%～70%。

1.1.2 藥物 平纖寧肺顆粒劑(由黨參、干地黃、玄參、黃精、桑白皮、黃芩、金銀花、虎杖、當歸、丹參、紅景天、川芎、甘草組成)，由江陰天江藥業有限公司生產。

1.1.3 試劑與儀器 鹽酸博萊霉素，日本化藥株式會社，批號730342。Leica ASP300S全自動真空組織脫水機、Shandon包埋機、Shandon手動切片機、Shandon全自動染色機、OLYMPUS顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只SD大鼠隨機分4組：正常對照組、模型組、平纖寧肺顆粒劑高劑量治療組及平纖寧肺顆粒劑低劑量治療組各15只。4組動物飼養1周后造模，除正常對照組外，其余各組均用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于實驗臺上，頸部乙醇消毒后逐層暴露氣管，博來霉素(5 mg/mL)一次性氣管內注射(1 mL)，注射后立即將動物直立并旋轉，使藥液在肺內分布均勻；正常對照組在同樣的條件下氣管內注入相同體積的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 4組實驗動物于造模后2 h開始灌藥，中藥平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組比例為高劑量組：低劑量組=3∶1，低劑量組給予5 mL/kg，高劑量組給予15 mL/kg；正常對照組和模型組給予等量的生理鹽水，1次/d。

1.2.3 檢測指標與方法 每組動物于給藥后第7、14、28天各處死5只，取右肺置于10%福爾馬林液中固定；石蠟包埋；按6 μm厚連續切片4張，1張HE染色，3張分別為TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原免疫組化染色；備以光學顯微鏡觀察。免疫組化試驗步驟：1)石蠟切片常規脫蠟至水；2)PBS洗2遍，5 min/遍；3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10分鐘蒸餾水洗1次；4)抗原修復；5)PBS洗5 min；6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min；7)甩去多余液體，滴加一抗4 ℃過夜(過夜后在37 ℃復溫45 min)；8)PBS洗2次各5 min；9)滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；10)PBS洗2次各5 min；11)滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉菌抗生物素蛋白溶液，37 ℃孵育20 min；12)PBS洗2次各5 min；13)DAB顯色5～10 min在顯微鏡下掌握染色程度；14)蒸餾水洗終止染色，蘇木素復染；15)脫水，透明，封片，鏡檢。每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定肺內TGF-β1、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達。

2 結果

2.1 平纖寧肺顆粒劑對肺纖維化大鼠肺組織病理學的影響 每組動物于給藥后第7、14、28天各處死5只，取右肺置于10%福爾馬林液中固定；石蠟包埋；按6 μm厚連續切片，HE染色。病理組織學檢測表明：正常對照組大鼠肺臟肺小葉結構正常，肺泡上皮細胞未見明顯變性、壞死和脫落，肺泡壁無充血、水腫，肺泡腔及支氣管腔內無滲出物，間質未見炎細胞浸潤。模型組第7天肺泡間質可見輕度炎細胞浸潤，纖維結締組織增生；第14天,有較多炎性細胞浸潤，伴有大量的纖維結締組織增生；第28天，肺泡結構破壞，纖毛粘連倒伏、變性、壞死，間質可見中度炎細胞浸潤，纖維結締組織重度增生。平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組大鼠肺也出現炎細胞浸潤，纖維結締組織增生病理表現，但在第14、28天的病理變化均較同期模型組減輕，其中以中藥高劑量治療組最為顯著。見表1，圖1。

2.2 平纖寧肺顆粒劑對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的影響 模型組與正常對照組比較，TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原平均光密度在第7、14、28天均明顯高于同期正常對照組，說明其表達明顯增強，與正常對照組比較有統計學意義(P<0.01)。平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原平均光密度與同期模型組比較明顯降低，有統計學意義(P<0.05，0.01)，但仍比正常對照組高(P<0.05，0.01)，說明平纖寧肺顆粒劑可以有效抑制TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。見表2，圖2、圖3、圖4。

表1 平纖寧肺顆粒劑對肺纖維化大鼠肺組織病理學的影響

表2 平纖寧肺顆粒劑對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的影響±s，n=5)

注：與正常對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05、△△P<0.01。

3 討論

肺纖維化常常歸屬于中醫“肺痿”“肺痹”范疇，有醫家提出正氣虛損、痰瘀互結的病理機制，我們總結臨床病例的基礎上提出肺腎不足，氣陰耗傷，兼痰、熱、瘀等病理產物為患的病機，確定補肺腎、清痰熱、祛血瘀的治療大法，故擬平纖寧肺顆粒劑治療肺纖維化。通過實驗觀察，鹽酸博萊霉素制造的大鼠肺纖維化模型早期以肺泡炎為主，后期以間質纖維化改變為主，平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組大鼠肺也出現炎細胞浸潤、纖維結締組織增生的病理表現，但在第14、28天的病理變化均較同期模型組減輕，其中高劑量組最為顯著，說明平纖寧肺顆粒劑能改善大鼠肺纖維化的病理變化。眾多研究表明[4-13]轉化生長因子β1是細胞外基質沉積最強的促進劑，還能抑制膠原的降解，在肺纖維化發病機制中的作用顯著，說明抑制轉化生長因子β1的產生或阻斷其表達途徑可抑制肺纖維化的疾病進展。實驗中平纖寧肺顆粒劑高、低劑量組轉化生長因子β1的平均光密度與同期模型組比較明顯降低，表明平纖寧肺顆粒劑有抑制轉化生長因子β1表達的作用。大鼠和人在發生肺纖維化時，膠原代謝出現紊亂，以Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增加為主，Ⅰ型和Ⅲ型膠原比例失調，導致膠原在肺間質中沉積，使肺組織基質結構紊亂而發生肺纖維化[13-14]。顯然發生肺纖維化時，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原含量可以改善肺纖維化。有人發現[15]氣虛血瘀證患者Ⅲ型膠原含量明顯增高，而益氣活血可顯著降低其含量，平纖寧肺顆粒劑組方能補益肺氣，活血化瘀，實驗亦顯示平纖寧肺顆粒劑能明顯抑制肺纖維化大鼠模型Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，具有抗肺纖維化的作用，為臨床治療肺纖維化提供了有利依據。

圖1 給藥7 d、14 d、28 d之后HE染色結果

續圖1 給藥7 d、14 d、28 d之后HE染色結果

圖2 給藥7 d、14 d、28 d之后大鼠肺組織TGF-β1免疫組化染色結果

圖3 給藥7 d、14 d、28 d之后大鼠肺組織Ⅰ型膠原免疫組化染色結果

圖4 給藥7 d、14 d、28 d之后大鼠肺組織Ⅲ型膠原免疫組化染色結果

續圖4 給藥7 d、14 d、28 d之后大鼠肺組織Ⅲ型膠原免疫組化染色結果

本實驗結果表明平纖寧肺顆粒劑有減輕肺泡炎和抗肺纖維化的作用，且有劑量依賴關系，提示應用

中醫復方平纖寧肺顆粒劑治療肺纖維化具有可行性，但仍需從藥物劑量、藥物安全性及其作用機制等方面進行進一步的探討。

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(2016-04-18收稿 責任編輯：徐穎)

Effect of Pingxianningfei Granule on the Expression of TGF-β1, TypeⅠand Type Ⅲ Collagen in Rats with Pulmonary Fibrosis

Zhang Chuanming1, Mao Junqing1, Zhu Qinmei2, Chen Jing1

(1YangzhouHospitalofChineseMedicine,Yangzhou225002,China; 2YangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou225009,China)

Objective:To observe the protection effect of Pingxianningfei Granule in rats with Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Methods:Sixty male SD rats were randomly divided into a control group, a model group(MG), a high-dose Pingxianningfei Granule group(HG) and a low-dose Pingxianningfei Granule group(LG), 15 in each. Model rats with Pulmonary Fibrosis were induced by injecting bleomycin into trachea. Respectively, 7, 14, 28 days after successfully medication, the rats were sacrificed, 5 in each group. Taking the lung, and analysis in histopathology. And the expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1), typeⅠand type Ⅲ Collagen in lung tissue was assayed by immunohistochemistry. Results:Infiltration of inflammatory cells were obvious in lung tissue of MG and the fibrous connective tissue proliferated. The pathologic changes of lung in HG and LG at 14, 28 days were milder than those in MG. The expression of TGF-β1, typeⅠand type Ⅲ Collagen in MG at 7, 14, 28 days was much higher than that of the control group, with statistical significance (P<0.01). Compared with the MG, the expression of TGF-β1, typeⅠand type Ⅲ Collagen of the lung in HG and LG was decreased, which showed significant difference (P<0.05, 0.01).Conclusion:Pingxianningfei Granule can effectively reduce the formation of pulmonary fibrosis and inhibit the expression of TGF-β1, typeⅠand type Ⅲ Collagen in lung tissue.

Pingxianningfei Granule; Pulmonary fibrosis; Pathology; TGF-β1; Collagen typeⅠ; Collagen type Ⅲ

江蘇省中醫藥局科技項目(編號：LZ13190)

張傳名(1977.02—)，男，碩士，副主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：中醫肺病學，E-mail：821767383@qq.com

茆俊卿(1959.05—)，女，碩士，教授，主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：中醫肺病學，E-mail：zgyz1955@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.041