栝樓桂枝湯對活化小膠質細胞抗炎作用的研究*

胡海霞 朱曉勤 李鉆芳 林如輝 陳立典

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2福建中醫藥大學康復醫學院 福州 350122）

●中西藥苑●

栝樓桂枝湯對活化小膠質細胞抗炎作用的研究*

胡海霞1朱曉勤1李鉆芳1林如輝1陳立典2#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2福建中醫藥大學康復醫學院 福州 350122）

目的：探討栝樓桂枝湯對活化小膠質細胞抗炎因子的表達水平及上游炎癥信號通路的活化情況。方法：先用MTT實驗篩選出藥物的最佳干預濃度，然后體外LPS刺激制備出小膠質細胞的細胞炎癥模型，經栝樓桂枝湯水提液處理后，應用ELISA法、RT-PCR法、Western-blotting法分別檢測細胞抗炎因子的表達及相關炎癥信號通路蛋白的表達水平。結果：栝樓桂枝湯水提液可顯著促進LPS誘導的小膠質細胞中抗炎因子的表達，并上調相應通路蛋白的表達水平。結論：栝樓桂枝湯可通過TRIF信號通路發揮抗神經炎癥的作用。

神經炎癥；栝樓桂枝湯；小膠質細胞；抗炎

小膠質細胞（M icroglia，MG）是公認的中樞神經系統中主要的固有免疫細胞，約占成年中樞神經系統細胞總量的10%～20%[1]，主要介導中樞神經系統損傷等疾病的免疫反應，在免疫調節過程中發揮核心作用[2]。神經炎癥反應的標志就是MG的激活[3]，MG作為CNS固有的免疫效應細胞參與缺血性中風過程中的免疫反應和病理過程[4]。在中樞神經系統中，TLR4主要表達于小膠質細胞，而TLR4所識別的外源性配體主要為LPS。前期實驗研究[5]已證實栝樓桂枝湯可以抑制LPS刺激所引起的細胞促炎因子的表達，且可能與炎癥通路TLR4/NFkB有關。本實驗中，先用MTT實驗檢測細胞活力后得出最佳刺激濃度，再以LPS干預小膠質細胞在體外制備小膠質細胞炎癥模型，然后用栝樓桂枝湯水提液進行干預處理，觀察藥物對于活化小膠質細胞中抗炎因子的影響作用，并探討其可能的作用機制。現報告如下：

1 材料

1.1 細胞小鼠源小腦膠質瘤細胞BV2（購自上海復祥生物科技有限公司），源自C57BL/6小鼠小膠質細胞，成纖維樣細胞，半貼壁生長。

1.2 藥物栝樓桂枝湯組方：栝樓根30 g，桂枝9 g，芍藥9 g，甘草6 g，生姜9 g，大棗12枚（藥材購自福州國醫堂醫藥公司）。

1.3 試劑高糖DMEM培養基、胰蛋白酶、青鏈雙抗、PBS緩沖液（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），LPS（Escherichia coli 055：B5）、MTT（美國Sigma公司），DEPC處理水（上海基爾頓生物技術公司），Trizol（美國Invitrogen公司），反轉錄試劑盒（美國Promega公司），SYBR-GreenⅠ定量PCR試劑盒（日本Takara公司），引物合成（上海生工生物工程公司），ELISA kit IFNβ、IL10（美國R&D公司），大鼠抗TLR3、TRIF（美國Santa Cruz公司），PVDF膜（美國M illipore公司），RAPI細胞裂解液、凝膠配制試劑盒、化學增強發光試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。

1.4 儀器SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰儀器設備有限公司）；ELX808酶標儀（美國BioTek公司）；HF212UV CO2培養箱（香港力康儀器設備有限公司）；電泳儀、凝膠成像分析系統（美國Bio-Red公司），TS-100F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司），垂直電泳槽、轉移槽（北京六一儀器廠），凝膠成像分析系統（美國BioRad公司）。

2 方法

2.1 栝樓桂枝湯水提液的制備取栝樓根30 g，桂枝9 g，芍藥9 g，甘草6 g，生姜9 g，大棗12枚，浸泡0.5 h，加5倍量的水加熱回流2次，1 h/次，過濾，濾液合并，旋轉蒸發儀減壓濃縮，真空干燥成干浸膏，－20℃凍存備用。

2.2 細胞培養BV2培養于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞呈現80%匯合度后，用0.05%胰蛋白酶消化傳代，至對數生長期用于后續實驗。

2.3 MTT法篩選栝樓桂枝湯水提液干預濃度和細胞炎癥模型制備小膠質細胞株BV2生長至對數期，以5×104個/m l的細胞濃度接種于96孔板，LPS（1 μg/m l）和栝樓桂枝湯水提液（50 μg/m l、100 μg/m l、200 μg/m l）分別干預細胞24 h后，加入MTT（0.5 mg/m l）100 μl繼續培養4 h后，再加入培養級DMSO 100 μl溶解甲瓚，振蕩后在570 nm處檢測各孔吸光度值，觀察細胞的生長活力。本研究選用的細胞干預濃度為不影響細胞生長活力的濃度范圍。

2.4 ELISA法檢測細胞培養上清液中的炎癥因子細胞生長至對數增長期后，將細胞以5×105個/m l的細胞濃度接種于24孔板，貼壁過夜后，按如下分組：對照組、LPS（1 μg/m l）干預組、栝樓桂枝湯（50 μg/m l）+LPS組、栝樓桂枝湯（100 μg/m l）+LPS組、栝樓桂枝湯（200 μg/m l）+LPS組，每組各3孔。干預24 h后，收集各組的細胞培養上清，按照TGFβ、IL10的ELISA試劑盒說明書操作，檢測培養上清液中抗炎因子的含量。

2.5 Western-blotting實驗檢測炎癥相關蛋白的表達水平細胞以5×105個/m l的細胞濃度接種于細胞培養瓶（規格為25 cm2），用與2.5相同的干預方式干預細胞24 h，干預結束后，提取細胞總蛋白/核蛋白，按每20 mg組織加200～400 μl的比例加入裂解液，冰上放置30 m in，每隔10 m in搖晃1次助融。然后將EP管置于低溫離心機中，4℃，12 000 r/m in離心15 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量法測定樣本蛋白濃度。進行SDS-PAGE凝膠電泳及轉膜，轉膜結束后，取出轉移膜放入封閉液中，在搖床上常溫封閉1 h。用封閉液稀釋一抗（抗體稀釋度為1∶1 000），封閉結束后將膜浸入配制好的一抗中，置于4℃冰箱過夜。將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液（抗體稀釋度為1∶3 000）中，置于搖床上室溫反應1 h。用TBST洗膜，增強化學發光法（ECL）顯色：置于凝膠成像分析系統進行顯色并拍照。實驗結果應用Gel Doc凝膠成像系統進行半定量分析。

2.7 統計學分析采用SPSS15.0統計軟件（One-way ANOVA）進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，組間數據比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 栝樓桂枝湯對小膠質細胞生長活力的影響MTT實驗結果表明，栝樓桂枝湯在50 μg/m l、100 μg/m l、200 μg/m l濃度范圍內對細胞活力的影響相比較，差異無統計學意義，即對BV2細胞沒有毒性。說明栝樓桂枝湯在該濃度范圍內可用于后續細胞實驗的干預。見圖1。

圖1 MTT法觀察栝樓桂枝湯對小膠質細胞（BV2）生長活力的影響

3.2 栝樓桂枝湯對小膠質細胞炎癥介質基因和蛋白表達水平的影響LPS刺激小膠質細胞活化后可釋放抗炎因子TGFβ、IL10等，但主要釋放哪類因子與細胞的活化狀態和時間有關。抗炎因子TGFβ、IL10在LPS刺激細胞后變化不明顯，而栝樓桂枝湯可促進抗炎因子的分泌，P＜0.05，與蛋白表達實驗結果一致；RT-PCR結果提示，小膠質細胞經LPS活化后TGFβ、IL10等抗炎因子的基因表達量沒有顯著變化，P＞0.05；栝樓桂枝湯可以促進抗炎因子的基因表達，P＜0.05。見圖2～圖3。

圖2 栝樓桂枝湯對小膠質細胞炎癥介質分泌水平的影響

圖3 栝樓桂枝湯對小膠質細胞炎癥介質基因表達水平的影響

3.3 栝樓桂枝湯對炎癥相關通路蛋白表達水平的影響TLR3是唯一啟動MyD88非依賴性途徑TRIF-IRF3的Toll樣受體。LPS干預小膠質細胞BV2后，TLR3和TRIF的基因及蛋白表達水平變化不大，P＞0.05；而栝樓桂枝湯可以濃度依賴性促進TLR3和TRIF基因和蛋白水平的升高，差異有統計學意義，P＜0.05。見圖4～圖5。

圖4 栝樓桂枝湯對小膠質細胞IRF3介導的通路蛋白基因表達的影響

圖5 栝樓桂枝湯對小膠質細胞IRF3介導的通路蛋白表達的影響

4 討論

小膠質細胞在神經炎癥調節中發揮著關鍵的作用。在正常生理狀態下，小膠質細胞呈靜息狀態，當腦缺血損傷發生時，小膠質細胞被活化，但小膠質細胞的過度激活會啟動強烈的免疫應答，釋放大量炎性因子和細胞毒性物質，引發神經元損傷[6～7]。

在人類中樞神經系統中小膠質細胞可表達TLR1-9[8]，基于募集特異的銜接蛋白，TLRs誘導的信號轉導通路主要有MyD88依賴和非MyD88依賴的兩個信號轉導通路[9]。最近的研究證實，TLRs家族中TLR3發揮著重要的抗炎作用。TLR3特異性募集銜接蛋白TRIF可啟動TRIF依賴性途徑從而誘導一系列神經保護因子的表達，如IFNβ、TGFβ、IL10、BDNF（Brain Derived Neurotrophic Factor）、神經營養蛋白4（Neurotrophin）、多效生長因子（Pleiotrophin）等，以上這些因子均已證實具有抗炎和/或神經保護作用。研究顯示，TGFβ具有很強的抗炎活性，它能降低腦梗死面積和減輕腦水腫，修復腦組織損傷[10]，對興奮性神經毒素和缺氧所致的神經細胞死亡發揮重要的保護作用[11]。Bsibsi等[12]的研究表明，TLR3激活后還可上調膠質細胞表達抗炎細胞因子IL10，IL10本身可減少MCAO大鼠的腦梗死體積[13]，且與正常小鼠相比，IL10缺乏的小鼠的神經細胞對興奮性毒性和低糖低氧所致損傷更敏感[14]。TLR3的信號通路則是由銜接蛋白TRIF啟動的MyD88非依賴性途徑，TRIF被招募至受體啟動IKKε磷酸化，最終活化轉錄因子IRF3、IRF7的活化，轉移到細胞核，產生抗炎因子TGFβ等[15]。

本實驗首先采用MTT法檢測了細胞存活率的變化，通過觀察藥物對小膠質細胞的毒性作用影響，篩選LPS和栝樓桂枝湯的干預濃度。與對照組相比，LPS和栝樓桂枝湯干預組中細胞存活率未見顯著改變，表明LPS在1 μg/m l、栝樓桂枝湯在50～200 μg/m l濃度范圍對小膠質細胞無明顯毒性影響，即后續實驗中選用LPS和栝樓桂枝湯的相應濃度范圍干預結果是在不影響小膠質細胞活力的前提下得出的。

實驗結果顯示，用LPS干預小膠質細胞后，栝樓桂枝湯在抑制TLR4途徑活化的情況下[4]，同時激活了TLR3信號途徑，TLR3/TRIF/IRF3信號途徑可啟動抑炎因子的表達，包括TGFβ、IL10等，且與該通路相關的蛋白水平也顯著升高，而LPS刺激組中TLR3/TRIF信號通路無明顯變化，因此，可以推斷，栝樓桂枝湯對小膠質細胞活化的抑制作用是雙向調節完成的，即是通過下調TLR4信號和TLR3信號而實現其抑制作用的，維持一定的內環境，即調控小膠質細胞中TLR3通路的活化狀態可能是栝樓桂枝湯發揮潛在的神經保護作用的機制之一。

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R743

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.090

2016-12-30）

國家自然科學基金（編號：81403265）

#通訊作者：陳立典，E-mail：cld@fjtcm.edu.cn