西洋菜鋅鐵轉運蛋白NoZIP1基因的克隆及表達研究

張秋玲，盧曉丹，鐘燕珊，傅明輝

（廣東工業大學輕工化工學院，廣東 廣州 510000）

西洋菜鋅鐵轉運蛋白NoZIP1基因的克隆及表達研究

張秋玲，盧曉丹，鐘燕珊，傅明輝

（廣東工業大學輕工化工學院，廣東 廣州 510000）

對西洋菜鋅鐵轉運蛋白基因NoZIP1進行克隆及表達分析，為研究其在西洋菜生長發育過程中的生物學功能奠定基礎。利用RACE技術克隆西洋菜NoZIP1基因，用生物信息學方法分析獲得的基因序列結構，利用實時熒光定量PCR研究NoZIP1基因在不同組織及不同培養條件下的表達特性。結果表明，西洋菜NoZIP1基因cDNA全長1 239 bp，包含完整的閱讀框，編碼356個氨基酸。實時熒光定量PCR分析顯示，NoZIP1基因的表達在鋅或者鐵脅迫條件下根、葉中均有誘導上調趨勢。

西洋菜；鋅鐵轉運蛋白；RACE；實時熒光定量PCR

鋅和鐵是植物生長所必需的微量元素，在植物體內的許多生化反應中起著重要作用［1］。鋅是生物體300多種酶的輔助因子，同時是生物體內重要蛋白質的結構輔助因子［2］，不僅參與生物體的各種代謝，在生物膜的穩定及基因表達等生理機能中也具有重要作用［3］。鐵在細胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應過程中發揮重要作用，是重要的電子傳遞體。鐵元素在原核和真核生物的生命活動中具有不可替代的功能［4］。缺鋅或者缺鐵都會影響植物的生長發育，但積累過量的鋅和鐵都會對植株造成一定的毒害作用［5-6］。植物在長期進化過程中為適應不良環境脅迫形成了一系列應答機制，這些應答反應往往通過植物細胞內基因表達的變化來實現，已發現一些與鋅鐵吸收和運輸有關的基因在應對鋅鐵脅迫中起重要作用。其中研究較多的是ZIP家族［7］。ZIP家族即鋅調控轉運體（Zinc-regulated transporter，ZRT）和鐵調控轉運體（Iron-regulated transporter，IRT），多數存在于真核細胞中，植物體內的ZIP家族基因可轉運Cd2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等多種金屬離子，但不同的ZIP家族成員對金屬離子作用的特異性不同，對金屬離子作用的濃度范圍也不同［8-10］。

目前已在擬南芥、水稻、大豆、玉米、苜蓿和番茄等多種植物中發現了ZIP家族基因［11-15］。研究ZIP基因功能時發現，在擬南芥中，AtZIP1-4均能轉運鋅，AtZIP1和AtZIP2還能轉運銅；而AtIRT1能轉運鋅、鐵、錳、鎘，其對Zn2+的轉運在pH＜4.5時才具備，AtIRT2能轉運鋅和鐵，不轉運錳和鎘［16］。水稻中OsZIP1、OsZIP3、OsZIP4和OsZIP8均具有轉運鋅的功能，OsZIP1、OsZIP3不能轉運鐵和錳，OsZIP4不能轉運鐵［3，12］。苜蓿中MtZIP1、MtZIP5和MtZIP6能轉運鋅，MtZIP4和MtZIP7能轉運錳，MtZIP3、MtZIP5和MtZIP6能轉運鐵［17］。這些都表明ZIP蛋白雖能轉運多種金屬離子，但很多ZIP蛋白轉運離子具有專一性，而目前對西洋菜中的ZIP家族基因研究較為罕見。西洋菜（Nasturtium officinale R.Br.）又名豆瓣菜，是一種從國外引進的水生蔬菜，在廣東、廣西等省栽培較多，口感嫩脆，深受人們喜愛，具有一定的食用與藥用價值［18］。研究表明，西洋菜是一種重要的防癌蔬菜，對心血管疾病、糖尿病、神經性疾病等慢性疾病也有一定的防御作用［19-20］。我們以西洋菜為材料，利用RACE技術成功地克隆了完整的鋅鐵轉運蛋白基因全長，對其同源性及相應蛋白的結構和功能進行了預測分析，并運用實時熒光定量PCR分析方法對不同環境條件下該基因的表達情況進行研究，了解NoZIP1基因的分子特征，為下一步研究其在西洋菜生長發育過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西洋菜購于廣州大學城南亭市場。RNA提取試劑、3′RACE試劑盒以及克隆步驟中PCR、反轉錄反應所使用的相關試劑及大腸桿菌感受態均購自TaKaRa公司，smarter Race試劑盒購自Clontech公司，引物合成及基因測序由上海Introvigen公司完成。

1.2 植物培養與取樣

將西洋菜于砂石基質中培養，培養液為1/2 濃度的Hoagland營養液，環境溫度為25 (± 2）℃，相對濕度為70(±5 ) %，培養時間為2～3 d。待西洋菜根系長出后，進行缺鋅處理（原營養液去掉Zn源培養）。培養3～4 d后對根部進行取樣，液氮迅速研磨后放入-80℃冰箱保存備用。

1.3 西洋菜根系總RNA的提取

采取Trizol提取法提取西洋菜根系總RNA。取西洋菜根系0.1 g，液氮研磨后，裝入已加1 mL RNAiso Plus裂解液的離心管中，劇烈振蕩30～60 s；加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；4℃下12 000 g離心15 min；取上清加等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min；4℃下12 000 g離心10 min；小心棄去上清，加1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）上下顛倒混勻，4℃下12 000 g離心5 min；棄上清，干燥RNA，溶于15 μL DEPC水中，于-80℃冰箱中保存備用。

1.4 西洋菜NoZIP1基因的克隆

1.4.1 RT-PCR獲得西洋菜ZIP基因的保守片段 以西洋菜總RNA為模板，Oligo dT為引物合成第一鏈cDNA。在NCBI中找出水稻、玉米、小麥等20多種單子葉被子植物鋅鐵轉運蛋白基因序列，利用iCODEHOP在線設計軟件設計1對簡并引物ZIP1F/ ZIP1R（表1）。以第一鏈cDNA為模板，ZIP1F/ZIP1R為引物進行PCR擴增獲得ZIP基因的保守片段。PCR反應程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 60 s，30個循環；72℃ 10 min。

表1 引物序列

1.4.2 西洋菜NoZIP1基因3′端克隆 根據已獲得的中間片段設計1對特異性引物ZIP2F/ ZIP2R（表1），參照Takara公司3′RACE試劑盒的說明書進行反轉錄和兩輪巢式PCR擴增得到西洋菜NoZIP1基因的3’端。第一輪PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、64.3℃ 30 s、72℃ 60 s，循環30次；72℃ 10 min。第二輪PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、57.7℃ 30 s、72℃ 60 s，循環30次；72℃ 10 min。

1.4.3 西洋菜NoZIP1基因5′端克隆 根據已獲得的保守片段及3′端片段設計1對特異性引物ZIP3F/ZIP3R（表1），參照Clontech公司smarter Race試劑盒說明書進行反轉錄和巢式PCR擴增得到西洋菜NoZIP1基因的5′端。第一輪PCR反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 2 min，循環5次；94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 2 min，循環5次；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 2 min，循環25次。第二輪PCR反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 2 min，循環5次；94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 2 min，循環5次；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 2 min，循環20次。

1.4.4 西洋菜NoZIP1基因cDNA全長克隆 將克隆得到的中間片段、3′端及5′端用DNAMAN軟件進行拼接，獲得西洋菜NoZIP1基因的cDNA全長序列。用NCBI在線ORF Finder找到該序列的開放閱讀框ORF，在ORF兩端設計1對全長引物ZIP4F/ZIP4R（表1），以cDNA為模板進行普通PCR，擴增全長序列。PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、50.5℃30 s、72℃ 60 s，循環30次；72℃ 10 min。

1.5 西洋菜NoZIP1基因編碼蛋白的生物信息學分析

蛋白質的基本理化性質用PortParam （http：//web.expasy.org/protparam）進行分析，蛋白質親疏水性用PortScale （http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析，用TMHMM Server v.2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質進行跨膜區分析，信號肽預測用SignalP （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），亞細胞定位用TargetP（http：//cbs.dtu.dk/services/ TargetP/），NoZIP1蛋白的保守結構區域用SMART數據庫（http：//smart.Embl-heidelberg. De/）分析，利用BLASTX進行NCBI蛋白質全庫的相似性搜索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）。ClustalW2多序列比對后用Mega7.0構建分子進化樹（鄰接法）。

1.6 西洋菜NoZIP1基因的實時熒光定量表達分析

對用1/2 濃度的Hoagland營養液培養已長出根系的西洋菜設置5種處理：缺鋅處理（原營養液去掉Zn源培養）、50%鋅處理（去掉原營養液一半的Zn源）、缺鐵處理（原營養液去掉Fe源）、50%鐵處理（去掉原營養液一半的Fe源）、缺Zn & Fe處理（去掉原營養液的Zn源和Fe源）。培養4 d并在每天的固定時間對根部和葉部進行取樣，液氮迅速研磨后放入-80℃冰箱中保存備用。

利用RNA提取試劑盒分別提取根部和葉部不同鹽處理1、2、3、4 d的總RNA，全營養處理的西洋菜作為對照，西洋菜肌動蛋白基因作為內參 （登錄號為：KX863723）。引物序列為Act-F/Act-R，根據上述獲得的NoZIP1基因全長序列設計定量引物G-F/G-R（表1）。按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（Takara）操作，兩步法進行PCR擴增：95℃ 30 s 進行1個循環，95℃ 5 s，51℃ 30 s進行40個循環反應，添加熔解曲線程序（從65℃到95℃，每5 s 增加0.5℃并讀取熒光值1次）。反應混合液在 Light Cycle 96 熒光定量儀中進行反應，每個樣品都設置3個重復。反應結束后獲得NoZIP1基因和內參基因Actin在各個樣品的Ct值 （threshold cycle），按照2-ΔΔCt方法對數據進行處理，計算基因在各個樣品中的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 西洋菜NoZIP1基因的克隆

克隆西洋菜NoZIP1基因的保守序列、3′端序列及5′端序列，均能擴增出750 bp左右的特異片段（圖1），回收特異片段進行測序，分別得到長度為662、521、475 bp的序列。

用DNAMAN軟件將得到的保守片段、3′端序列及5′端序列去掉重復片段后進行拼接，獲得西洋菜NoZIP1基因的cDNA全長序列。同時在該序列開放閱讀框的兩端設計引物（ZIP-2F/ZIP-2R），擴增出一條1 087 bp的特異片段（圖1）。將該片段進行測序，發現測序結果與拼接結果完全相同。序列提交NCBI獲得序列登陸號為KX858826。

圖1 電泳結果

2.2 西洋菜NoZIP1蛋白的生物信息學分析

對西洋菜NoZIP1基因的全長cDNA序列進行分析，結果表明，該序列全長1 239 bp，包括一個完整的閱讀框，含有1 071 bp核苷酸，共編碼356個氨基酸；5′和3′端非編碼序列長度分別為53 bp和115 bp。使用Portparam分析西洋菜NoZIP1基因編碼的氨基酸序列的理化性質，結果顯示，該序列的分子量為38.116 ku，理論等電點為6.45，總負電荷殘基數目為27，總正電荷殘基數目為23，分子式為C1705H2701N449O483S28，不穩定指數為37.49，屬于穩定蛋白，脂肪指數為102.25。利用在線工具對NoZIP1基因亞細胞定位進行預測，結果顯示，該蛋白的分泌途徑為S型，即定位在分泌通路，預測剪切位點序列為27個氨基酸。用在線工具PortScale對西洋菜NoZIP1基因編碼的氨基酸序列進行疏水性分析，窗口大小選擇9，結果表明（圖 2），該蛋白在N端、C端、跨膜區都存在明顯的疏水區。用ProtParam tool 分析該蛋白氨基酸的平均疏水系數為 0.477，說明該蛋白為疏水蛋白。

圖2 NoZIP1蛋白的親水性/疏水性分析

用TMHMM Server對蛋白進行跨膜區分析，預測結果（圖3，封二）顯示，該蛋白含有9個跨膜區（5～27、53～72、85～107、127～149、200～222、232～254、261～283、298～320、332～354），跨膜區的長度均為22個氨基酸殘基。表明該蛋白可能是一種跨膜運輸蛋白。用在線工具SignalP對蛋白進行信號肽預測，結果表明NoZIP1蛋白含有信號肽，可能在跨膜運輸中起信號識別作用，剪切位點位于第27～28位氨基酸之間。用在線工具SMART和InterProScan對蛋白質的結構域進行分析，結果顯示，NoZIP1蛋白第49～353位之間是個高度保守的結構功能域，即ZIP家族成員共有的典型結構域。同時利用Portfun 2.2 server對NoZIP1蛋白的功能進行預測，結果表明，NoZIP1蛋白參與金屬離子運輸和調控過程的功能概率最高為 0.773，說明NoZIP1蛋白在機體內可能有轉運Zn2+、Fe2+的功能。

2.3 西洋菜NoZIP1蛋白與其他ZIP類蛋白的系統進化樹及相似性分析

根據NoZIP1序列推導出的氨基酸序列在NCBI中Blast P的比對結果，選取蛋白序列同源性相對較高的薺藍（Camelina sativa L.，XP_010499439.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana Thal.，NP_187881.1）、木豆（Cajanus cajan L.，KYP36079.1）、鷹嘴豆（Cicer arietinum L.，XP_004488546.1）、野生大豆（Glycine soja Sieb.et Zucc.，KHN21378.1）、中棉（Gossypium raimondii UIbr.，XP_ 012463602.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum L.，XP_016706618.1）、川桑（Morus notabilis Schneid.，XP_010109875.1）、梅花（Prunus mume Sieb.，XP_008226052.2）、蓖麻（Ricinus communis L.，XP_002532140.1）、可可樹（Theobroma cacao L.，XP_007022739.1）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana Chod.，XP_010544345.1）、油菜（Brassica napus L.，XP_013586854.1）、綠豆（Vigna radiate L.，XP_014501490.1）、蘋果（Malus domestica Mill.，XP_008371921.1）、大豆（Glycine max L.，XP_003531480.1）等16種植物ZIP基因的氨基酸序列與西洋菜NoZIP1氨基酸序列構建系統發育樹。其中西洋菜與薺藍、擬南芥、油菜、醉蝶花的氨基酸序列相似性高達66%～90%。系統進化樹分析結果（圖4A）表明，西洋菜NoZIP1基因編碼蛋白與擬南芥、薺藍、醉蝶花的親緣關系較近，與川桑、蓖麻、梅花等的親緣關系較遠，且該蛋白分子進化歷程與物種進化歷程一致。同時下載具有代表性的擬南芥ZIP家族蛋白氨基酸序列AtZIP1～12及AtIRT1～3，使用MEGA7軟件鄰接法構建系統進化樹，結果（圖4B）顯示，NoZIP1蛋白與AtZIP1聚成一個分支，表明兩者親緣關系較近。

圖4 NoZIP1基因與其他植物ZIP基因氨基酸進化樹分析

2.4 西洋菜NoZIP1基因在不同組織中的表達情況

西洋菜NoZIP1基因在不同組織、不同培養條件下的表達情況見圖5和圖6。對圖5、圖6中的數據進行單因素方差分析發現，同一種處理下不同天數的相對表達量數值間P值均小于0.001，說明各處理條件下不同天數的表達量具有顯著性差異。從圖5、圖6可看出，NoZIP1基因在西洋菜根部和葉部的表達量總體均為先下降后上升，但根部表達量下降更快，第1天即較對照有較大幅度的下降，說明根部對缺營養素的響應比較迅速。根部中，表達量下降持續的時間為1～2 d，一般是從第2天開始表達量出現誘導上升并達到最大值。而雙缺和缺鐵條件下表達量最大值出現在第3天，較其他條件稍晚，但缺鐵條件下的表達量上升非常顯著。葉部中，表達量下降持續時間為2～3 d，比根部稍長，一般從第4天開始上升。綜上說明，NoZIP1基因在根部和葉部均能受缺營養素的影響而誘導表達，只是在不同組織中出現誘導的時間存在差異。

圖5 NoZIP1在根部不同條件下的相對表達量分析

圖6 NoZIP1在葉部不同條件下的相對表達量分析

3 結論與討論

本研究利用RACE技術成功克隆出1 條ZIP全長基因，通過系統進化樹聚類分析暫命名為NoZIP1。利用生物信息學方法分析，NoZIP1 蛋白具有9個跨膜域，1個信號肽序列（1～26）和1個ZIP家族特征序列（49～353），具有跨膜運輸活性和陽離子轉運載體結合位點，在 N 端、C 端、及跨膜區均存在明顯的疏水區，因此推測NoZIP1蛋白為跨膜運輸蛋白。實時熒光定量PCR分析表明，NoZIP1基因在根部和葉部均受誘導上調表達，其表達能夠響應外界鋅離子和鐵離子濃度變化。

西洋菜是一種具有一定藥用價值的可食用蔬菜，也是一種可對水體富營養化進行修復的蔬菜［21］，在惡劣生長環境下也能生長良好，體內有一套對不同環境脅迫的應答機制。植物體內對鋅、鐵的吸收，運輸，分配及維持細胞內鋅鐵離子的平衡穩定離不開一些蛋白家族的協同作用。與鋅鐵吸收的蛋白家族主要有ZIP家族、黃色條紋蛋白家族（yellow stripe-like，YSL）、自然抗性相關巨噬蛋白家族（The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP）及陽離子擴散輔助蛋白家族（Cation diffusion facilitator protien，CDF）等［22］。對ZIP家族功能結構特點進行研究發現，多數鋅鐵轉運蛋白含8個跨膜區及相似的膜拓撲結構，等電點在5～9.28之間，不穩定系數為27～44，ZIP蛋白長度為226～459個氨基酸，氨基酸數目的不同主要是因為Ⅲ、Ⅳ跨膜區間的“可變區”長度不同。一般認為，可變區位于胞內，且富含組氨酸殘基，可能與金屬離子的結合、轉運有關［23-24］。本研究采用生物信息學方法對西洋菜NoZIP1蛋白進行分析發現，西洋菜NoZIP1蛋白具有ZIP家族基因的一些基本特征，且在第49～353位氨基酸之間有ZIP家族成員共有的典型結構域，因此推斷NoZIP1是ZIP家族成員之一。在用NCBI的Blast P進行氨基酸序列比對時發現，NoZIP1與其他16種植物的ZIP1蛋白相似性達57%～90%，故將本研究中克隆得到的基因暫命名為NoZIP1。在進行系統分子進化樹構建時發現，該蛋白分子進化歷程與物種進化歷程一致，同一分支中均為雙子葉植物。與擬南芥ZIP家族構建系統進化樹的結果中顯示，NoZIP與AtZIP1屬同一分支，親緣關系最近，且西洋菜本身也屬于南芥族，故推測NoZIP1與AtZIP1可能具有相似的功能。

在對ZIP蛋白表達情況的研究時發現，ZIP家族成員編碼的基因在許多植物的各個不同器官中（籽粒、花、根、莖、根瘤）都有表達，但表達模式呈現一定的差異性［25］。目前已在擬南芥中發現了16個ZIP家族基因，且AtIRT1是最早被發現的ZIP 家族成員，主要在根部表達［26-28］。研究發現，AtZIP1、AtZIP5、AtZIP9 和AtZIP12受缺鋅誘導表達［29］，說明這些基因在缺鋅條件下可能增強對鋅的吸收。對水稻中的ZIP家族成員進行分析時發現，OsZIP1、OsZIP3、OsZIP8在根部和地上部中均受缺鋅誘導表達，其中OsZIP1在根部的表達量比地上部高，OsZIP7a在根部缺鐵誘導，OsZIP8在缺鐵時根和葉中的表達量均不高［30-31］。López-Millón等［17］從苜蓿中分離得到了MtZIP1和MtZIP3-7，半定量RT-PCR分析結果顯示，對苜蓿進行缺鋅處理時，MtZIP1在苜蓿的根和葉中都表達，MtZIP3 和MtZIP4在根和葉中表現為誘導表達，而MtZIP6和 MtZIP7沒有顯著變化。本研究中NoZIP1蛋白表達結果顯示，在缺營養素的條件下，NoZIP1在根部與葉部均受誘導表達，但表達情況具有一定差異。根部和葉部NoZIP1的表達趨勢基本都是先下降后上升，可能是植物對初遇不良環境表現出的應答機制。缺營養素條件下，植物生長生理受到影響，基因表達降低。之后啟動自身防御機制，表達一些基因對抗不利條件，因此出現先降后升的趨勢。但植物根部和葉部出現這樣趨勢的時間有一定差

異，根部NoZIP1基因表達量下降得更為顯著，尤其在雙缺或缺鐵的條件下。為對抗此兩種不利條件，誘導鋅鐵轉運蛋白基因的表達所需時間也要稍長，表現為其他缺營養素條件下都是第2天表達量開始上升且達到最大值，雙缺和缺鐵條件下，此變化出現在第3天。而缺鋅或50%缺鐵條件對植物的脅迫壓力較雙缺和缺鐵稍小，因此植物對抗不利條件誘導鋅鐵轉運蛋白基因的表達所需的時間也相對較短。后期即第4天開始植物整體的生長生理代謝受損，導致整體基因表達量出現下降。葉部對缺鋅鐵的脅迫反應響應速度較根部稍慢，表現在脅迫導致的基因表達量下降的較為緩慢。由于脅迫信號需從根部傳遞上來，因此葉部的響應速度比根部慢，對抗不利條件誘導基因表達也出現得比根部慢。

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（責任編輯 崔建勛）

Cloning and expression analysis of NoZIP1 gene in Nasturtium officinale R. Br.

ZHANG Qiu-ling，LU Xiao-dan，ZHONG Yan-shan，FU Ming-hui
（School of Chemical Engineering and Light Industry， Guangdong University of Technology，Guangzhou 510000，China）

To contribute to the further functional determination of the gene involving growth and development of Nasturtium officinale R. Br.，ZIP1 gene was cloned according to homologous gene conserved region by RACE method. Its sequences and expression characters were examined by bioinformatics and real-time PCR，respectively. The full-length cDNA was 1 239 bp and it encoded a polypeptide of 356 amino acids with an entire ORF. It had high similarity to ZIP proteins of other plants. By real-time PCR approach，it was found that the expression of NoZIP1 was significantly induced both in roots and shoots by zinc-deficiency or iron-deficiency.

Nasturtium officinale R.Br.；ZIP （Zrt，Irt like Protein）；RACE；real-time PCR

Q786

A

1004-874X（2017）02-0039-10

2016-12-05

國家自然科學基金（21177029）；廣東省科技計劃項目（2016A010105020）

張秋玲（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：qiuling92@163.com

傅明輝（1967-），女，博士，教授，E-mail：mhfugd@126.com

張秋玲，盧曉丹，鐘燕珊，等. 西洋菜鋅鐵轉運蛋白NoZIP1基因的克隆及表達研究［J］.廣東農業科學，2017，44 （2）：39-48.