插上“基因組測序”的翅膀，病原微生物檢測應用新進展

摘要：基因測序技術發展迅速，二代測序已代替一代測序被廣泛應用，三代測序也已進入市場。測序技術目前逐漸被應用于病原微生物的檢測，主要分為單一微生物de novo測序、單一微生物基因組重測序、復雜病原樣品的宏基因組測序，檢測結果快速精準。

關鍵詞：病原微生物；基因組測序；宏基因組

1977年，英國的Sanger利用DNA復制的生物學特性，設計了一種通過DNA復制來識別4種堿基的方法，即經典的雙脫氧核苷酸末端終止測序法（Dideoxy chain termination），揭開了DNA測序技術新篇章。尤其是高通量測序[1]的發展，使得短短10年，一個人類基因組的測序由10年前的30億美金發展到今天只要6000美金。測序技術快速發展推進了基因組測序應用于臨床病原微生物的檢測。2016年是我國精準醫療元年，也是基因組測序應用于臨床診斷飛速發展的一年。國家衛計委發布《關于印發遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016-2020）的通知》中支持耐藥菌感染快速診斷技術的研發，特別是快速鑒別細菌與非細菌感染的技術設備、耐藥菌快速檢測。

測序技術的發展

（一）一代測序

1977年，Sanger等提出了的雙脫氧核苷酸末端終止測序法，即在4個DNA合成體系中加入不同的放射性標記的ddNTP，通過電泳條帶放射性自顯影，根據條帶的位置測DNA分子的序列，隨后Gilbert等提出了化學降解法。Sanger 和Gilbert測序方法的提出標志著第一代測序技術的誕生。[1]

（二）二代測序（NGS）——高通量測序（HTS）

1990年，以熒光標記代替放射性同位素標記和毛細管電泳技術的發展大幅提高測序的通量。同時，研究者們又提出了焦磷酸測序法、連接酶測序法、雜交測序法等多種DNA序列測定方法。其中在焦磷酸測序法和連接酶測序法的基礎上分別發展出了Roche公司454測序方法，和ABI公司的SOLiD測序方法。454、SOLiD 與Illumina公司的Solexa技術，在2005-2007年短短三年時間內相繼推出，共同組成了第二代測序技術[1]。第二代測序技術的共同特點是極高的測序通量，使得測序周期和成本大幅降低，是目前微生物基因組測序的主流方法。

（三）三代測序

近兩年，以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術，被稱之為第三代測序技術[2]。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。SMRT技術的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術的通病），達到15%，但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯。納米孔單分子測序讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb，錯誤率目前介于1%至4%，且是隨機錯誤，而不是聚集在讀取的兩端。數據可實時讀取，通量很高（30x人類基因組有望在一天內完成），起始DNA在測序過程中不被破壞而且樣品制備簡單又便宜。理論上它也能直接測序RNA，并且能直接讀取甲基化的胞嘧啶。第三代測序有望解決目前測序平臺的不足。

測序技術應用于病原微生物檢測的類型

（一）單一微生物de novo測序

de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑[3]。目前主要利用二代測序技術進行de novo測序，臨床上常見病原微生物的標準菌株多數已完成測序。

（二）單一微生物基因組重測序（Genome Re-sequencing）

全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，通過構建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結合的策略對重要的病原微生物進行高通量測序。

（三）單一微生物測序應用概況

臨床上培養陽性的菌株可進行全基因組，24小時內可以完成鑒定，分型，耐藥基因和毒力基因的分析，速度快而成本低。H7N9流感病毒最初分離時就是采用全基因組測序進行鑒定的。目前大部分典型可培養病原微生物均已完成測序，精準程度是質譜技術無法相提并論的。

（四）復雜病原樣品的宏基因組測序（Magenomics）[3]

宏基因組測序研究的對象是整個微生物群落。相對于傳統單個細菌研究來說，它的優勢明顯。主要有以下兩點：（1）微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個群落環境及個體間的相互影響的，因此做宏基因組測序研究比做單個個體的研究更能發現其特性；（2） 宏基因組測序研究無需分離單個細菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養的微生物。

（五）病原微生物宏基因組應用實例

2010年，華大基因研究院和歐洲科學家研究發現人體微生物組分布在腸道菌群呼吸道，皮膚表面，占人總體重中的1-3%，基因種類為人體的十倍，被稱為人類第二基因組。從此開啟了微生物宏基因組測序的研究。

病原微生物的測序檢測展望

隨著測序技術成本的降低，病原微生物測序檢測將加速應用速度。非培養標本可直接檢測宏基因組，已培養菌株可進行全基因組測序進行分型，耐藥基因、毒力因子分析。病原微生物的測序技術將實現快速檢測（24小時內），全面覆蓋（目前是2700多種），達到精準醫療。

參考文獻：

[1] 解增言等.DNA測序技術的發展歷史與最新進展[J].生物技術通報，2010.8.

[2] 曹晨霞等.第三代測序技術在微生物研究中的應用[J]. 微生物學通報，2016.10.

[3] 秦楠等.高通量測序技術及其在微生物學研究中的應用[J]. 微生物學報，2011.4.