IL-10、TNF-α及SOCS3在妊娠期肝內膽汁淤積癥母胎界面的變化

曹麗瓊，蔣惠玲，阿米娜，易金玲

(新疆醫科大學第五附屬醫院產科，新疆 烏魯木齊 830000)

IL-10、TNF-α及SOCS3在妊娠期肝內膽汁淤積癥母胎界面的變化

曹麗瓊，蔣惠玲，阿米娜，易金玲

(新疆醫科大學第五附屬醫院產科，新疆 烏魯木齊 830000)

目的 探討白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及細胞因子信號轉導抑制子3(SOCS3)在妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)母胎界面的變化。方法 選取新疆醫科大學第五附屬醫院2013年10月至2016年10月ICP孕婦43例作為觀察組，選擇同期產檢的健康孕婦47例作為對照組。采用Envision免疫組化法測定兩組孕婦胎盤組織中IL-10、TNF-α的表達水平，采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和蛋白免疫印跡法(Western-blot)測定兩組孕婦胎盤組織中SOCS3的表達水平。結果 觀察組IL-10的表達明顯低于對照組，差異具有統計學意義(Z=-2.578，P<0.05)，TNF-α的表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(Z=-4.421，P<0.05)；觀察組的孕婦胎盤組織中SOCS3表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(Z=-2.325，P<0.05)；兩組患者SOCS3的OD值比較差異有統計學意義(t=565.702，P<0.05)。結論 ICP患者的母胎界面TNF-α表達增加，IL-10表達降低，胎盤組織中SOCS3參與了ICP的發病。

妊娠期肝內膽汁淤積癥；胎盤；細胞因子信號轉導抑制子3；白細胞介素-10；腫瘤壞死因子-α

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠中晚期特發疾病，其導致的死胎死產是圍產兒死亡的重要原因之一，而至今其發病機制仍未闡明。從生殖免疫學觀點來看，Th1/Th2型細胞因子網絡在調節妊娠免疫耐受中發揮重要作用[1]。而研究發現ICP孕婦的Th1/Th2型細胞因子的平衡發生變化，Th1的表達更明顯[2]。細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS3)是近年來新發現的一種負調控蛋白家族中的成員，這類成員主要負責細胞因子信號通路，與Th1/Th2細胞因子失衡、Th2免疫優勢有密切關系[3]，缺乏SOCS3可引起胎盤功能不全而導致死胎[4]。目前，關于SOCS3在ICP發病機制中的作用研究較少。本研究通過檢測ICP患者和健康孕婦胎盤組織中SOCS3、白細胞介素-10(interleukin 10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達水平，從而了解它們在ICP母胎界面的表達，初步探討SOCS3在ICP發病中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選取新疆醫科大學第五附屬醫院產科2013年10月至2016年10月經剖宮產分娩的ICP患者43例作為觀察組，所有孕婦均無肝膽疾病、免疫系統疾病及糖尿病等妊娠合并癥。選擇47例同期產檢的健康孕婦剖宮產分娩者作為對照組。觀察所用胎盤組織標本，經過醫院的倫理委員會批準，而且患者知情并同意。

1.2方法

1.2.1試劑

所用試劑包括：兔抗人SOCS3蛋白多克隆抗體(購自上海博耀生物科技有限公司)、蛋白質印跡法(WB)、二抗試劑盒(上海研生生化試劑有限公司)、β-微管蛋白(β-tubulin)(上海研生生化試劑有限公司)、預染蛋白Marker(分子量：20～118kD)[愛必信(上海)生物科技有限公司]、RIPA裂解液(RIPA lysis buffer)、蛋白上樣緩沖液(上海博耀生物科技有限公司)、免疫組化檢測試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)、兔抗人IL-10單克隆抗體和兔抗人TNF-α單克隆抗體(上海研生生化試劑有限公司)、SOCS3 ELISA試劑盒(上海恒遠生物有限公司)。

1.2.2標本收集及處理

兩組研究對象剖宮產術后，立即在無菌條件下進行胎盤組織的選取，胎盤組織主要位于臍帶附著處旁開2～3cm，分離出胎盤組織兩塊，用生理鹽水沖洗3遍，其中一塊放于10%甲醛中進行固定，時間為24～48h，固定后再依次進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋備用；另一塊放入采用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的環氧樹脂(EP)管中，-170℃液氮快速冷凍后轉入-80℃冰箱中進行保存。

1.2.3免疫組化法檢測胎盤組織中IL-10及TNF-α的表達

采用多聚體(Envision)免疫組化法測定IL-10、TNF-α，嚴格按照免疫組化試劑盒的說明書進行操作。Envision程序：脫蠟、水化組織切片；預處理組織切片，蒸餾水漂洗，置于三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)中。阻斷內源性過氧化物酶(僅用于Envision TM)；蒸餾水漂洗，置于TBS中10min，一抗孵育10～30min，TBS漂洗10min，Envision TM孵育10～30min，TBS漂洗10min，色源底物溶液孵育10min，蒸餾水漂洗，復染及封片后在顯微鏡下觀察細胞，并在450nm處進行光密度(OD)值測定。

1.2.4蛋白免疫印跡法測定胎盤組織中SOCS3的表達水平

按蛋白免疫印跡法(western-blot)標準流程(妊娠組織總蛋白的提取與定量→電泳→電轉膜→免疫反應)進行，具體操作按說明書上的步驟進行。結果在450nm處進行OD值測定。

1.2.5 ELISA法測定胎盤組織中SOCS3的表達水平

按照SOCS3 ELISA的說明書進行操作，將標準樣和標本樣處理后采用酶標儀進行測定。加入顯色底物(TMB)100微升/孔，于36℃的孵箱進行避光孵育15min。加入終止液100微升/孔，混勻后并在450 nm處進行OD值測定。

1.3統計學方法

2結果

2.1兩組一般資料比較

兩組孕婦在年齡、孕周方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

2.2 IL-10及TNF-α在胎盤組織的定位及表達

IL-10、TNF-α主要在胎盤滋養細胞胞質中表達，見圖1、圖2。IL-10、TNF-α在兩組孕婦胎盤組織中均有表達，觀察組IL-10的表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(Z=-2.578，P<0.01)，而TNF-α的表達水平則明顯高于對照組，差異有統計學意義(Z=-4.421，P<0.01)，見表2。

分組例數(n)年齡(歲)孕周(周)觀察組4333.2±6.238.3±5.9對照組4731.9±5.840.1±3.3t1.0281.806P0.3070.074

2.3 SOCS3在胎盤組織的表達水平

SOCS3在兩組產婦胎盤組織中均有表達，如圖3。觀察組的孕婦胎盤組織中的SOCS3表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(Z=-2.325，P<0.05)，見表2。

注：圖1A為滋養細胞胞質內有大量表達，胞質內可見棕褐色顆粒，呈強陽性反應；圖1B為滋養細胞胞質內有少量表達，胞質內可見淡黃色染色顆粒，呈弱陽性反應SP×400。

圖1 兩組IL-10的表達

Fig.1 Expression of IL-10 in two groups

注：圖2A為滋養細胞胞質內有少量表達，胞質內可見淡黃色染色顆粒，呈弱陽性反應；圖2B為滋養細胞胞質內有大量表達，胞質內可見棕褐色顆粒，呈強陽性反應SP×400。

圖2 兩組TNF-α的表達

Fig.2 Expression of TNF-α in two groups

表2 兩組產婦IL-10及TNF-α在胎盤組織的表達

圖3 兩組SOCS3的表達

Fig.3 Expression of SOCS3 in two groups

2.4 SOCS3的ELISA結果

觀察組的OD值為0.698±0.002，對照組的OD值為0.236±0.005，差異有統計學意義(t=565.702，P<0.05)。

3討論

3.1 IL-10及TNF-α在胎盤組織的定位及表達

ICP是一種多病因疾病，其臨床危害主要在胎兒方面，故母胎界面的異常改變成為研究的著眼點。正常妊娠時胎盤作為免疫隔離部位，使遺傳父親基因的胎兒不受到排斥，因此可以起到免疫耐受的作用。有研究表明正常妊娠時孕婦存在Th2免疫優勢，可以避免胎兒的不良結局[4]。國內有研究表明ICP患者的外周血免疫球蛋白降低，從而導致患者血清CD4/CD8比值不斷增高，而淋巴細胞轉化率不斷降低[5]，因此Th1型細胞因子TNF-α、干擾素(IFN)-β升高而Th2型細胞因子IL-4降低[6]，母胎間免疫平衡失調，進而導致該病的發生，同時也會導致母嬰的不良結局發生。本研究通過對ICP患者和正常妊娠孕婦的TNF-α、IL-10在胎盤組織中的表達進行分析，結果顯示ICP患者的TNF-α表達水平要比正常孕婦高，而IL-10表達要低于正常妊娠孕婦，這個結果說明TNF-α、IL-10在ICP患者母胎界面的表達異常，不利于母嬰的結局。

3.2 SOCS3在ICP母胎界面的變化

SOCS是連接蛋白-信號轉導子和轉錄激活子(JAK-STAT)信號通路中的負向調節蛋白，可抑制多種細胞因子的信號通路，并參與T細胞的分化和免疫調控，其表達不足或缺陷，會破壞免疫耐受，導致相應疾病[7]。SOCS3在機體免疫調控中的作用最突出，研究表明SOCS3促進Th1/Th2平衡向Th2偏倚[8]。本研究發現，ICP時母胎界面SOCS3的表達下降，這一結果與董倩等[9]的研究結果部分相符。因此，ICP患者的母胎界面SOCS3表達下降，從而導致胎盤滋養層IL-10的表達不足，使胎盤滋養層受到損害，使母體對胎兒的免疫排斥不斷增強，從而出現死胎。

本研究ICP患者胎盤組織中的SOCS3表達降低，從而導致患者的免疫力降低，打破Th1/Th2平衡，從而影響到患者和胎兒的健康，發生不良結局的幾率也會增加。因此分析ICP患者的胎盤組織中的TNF-α、IL-10和SOCS3的表達，可以分析ICP患者的發病情況，而且可以通過相應的治療，減少患者及新生兒的不良結局的發生，進而對準確及詳細地分析ICP患者提供一定的參考。

綜上所述，ICP患者的母胎界面TNF-α表達增加，而IL-10表達降低，胎盤組織中SOCS3參與了ICP的發病。

[1]王文琦,孫麗洲.SOCS3與妊娠相關疾病的研究進展[J].江蘇醫藥,2014,40(4):447-449.

[2]Namkung J H,Lee J E,Kim E,etal.Association of single nucleotide polymorphisms in the IL-12 (IL-12A and B) and IL-12 receptor (IL-12Rbeta1 and beta2) genes and gene-gene interactions with atopic dermatitis in Koreans[J].J Dermatol Sci,2010,57(3):199-206.

[3]Qiu F,Song L,Yang N,etal.Glucocorticoid downregulates expression of IL-12 family cytokines in systemic lupus erythematosus patients[J].Lupus,2013,22(10):1011-1016.

[4]Gran B,Zhang G X,Yu S,etal.IL-12p35-deficient mice are susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis: evidence for redundancy in the IL-12 system in the induction of central nervous system autoimmune demyelinationn[J].J Immunol,2002,169(12):7104-7110.

[5]Szántó S,Aleksza M,Mihály E,etal.Intracytoplasmic cytokine expression and T cell subset distribution in the peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis[J].J Rheumatol,2008,35(12):2372-2375.

[6]莫勁思,董小萍,蘇寶蘭.妊娠期肝內膽汁淤積癥患者的早產預測指標[J].中國婦幼健康研究,2014,25(3): 440-442.

[7]周欣,孫麗洲.細胞因子信號傳導抑制因子3與妊娠的研究進展[J].國際婦產科學雜志,2013,40(3):203-206.

[8]溫娜,張巧玉,王振國.細胞因子信號轉導抑制因子3在早產胎盤中的表達及臨床意義[J]．醫學綜述,2015,21(18):3394-3396.

[9]董倩,李衛平.Th17細胞和調節性T細胞與母胎免疫耐受的關系[J].上海交通大學學報:醫學版,2012,32(11):1525-1528.

[專業責任編輯：楊文方]

Changes of IL-10, TNF-α and SOCS3 at maternal-fetal interface of ICP patients

CAO Li-qiong, JIANG Hui-ling, A Mi-na, YI Jin-ling

(DepartmentofObstetrics,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUrumqi830000,China)

Objective To study the changes of interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) at maternal-fetal interface of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP). Methods From October 2013 to October 2016, 43 pregnant women with ICP in the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected in observation group, and 47 healthy pregnant women taking prenatal examination in the same period were selected in control group. The expressions of IL-10 and TNF-α level in placenta of two groups were determined by Envision immunohistochemical method, and the expression level of SOCS3 was determined by ELISA method and Western blot (Western-blot) method. Results The expression of IL-10 of the observation group was significantly lower than the control group with statistical significance (Z=-2.578,P<0.05), but the expression of TNF-α was significantly higher (Z=-4.421,P<0.05). The expression of SOCS3 of the observation group was significantly lower than the control group with statistical significance (Z=-2.325,P<0.05). There was obvious difference in OD value of SOCS3 between two groups (t=565.702,P<0.05). Conclusion The expression of TNF-α increases but IL-10 decreases in maternal-fetal interface of patients with ICP, and SOCS3 in placenta is involved in the pathogenesis of ICP.

intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP); placenta; supressor of cytoking signaling3(SOCS3); interleukin 10 (IL-10); tumor necrosis factor α(TNF-α)

2016-11-16

曹麗瓊(1975-)，女，主治醫師，碩士研究生，主要從事為妊娠免疫及妊娠合并癥的診治工作。

易金玲，副主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.013

R714.2

A

1673-5293(2017)03-0259-03