鹽酸小檗堿對大鼠主動脈內皮細胞增殖與凋亡的作用

梁寶今　蒙如慶　周卓東　梁濤

[摘要]目的 觀察鹽酸小檗堿對大鼠主動脈內皮細胞增殖與凋亡的作用，以探討鹽酸小檗堿促進內皮細胞凋亡的機制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿分別干預大鼠主動脈內皮細胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法檢測細胞增殖活性，Western Blot方法檢測促凋亡蛋白BAX的表達。結果 不同濃度鹽酸小檗堿作用于大鼠主動脈內皮細胞可顯著抑制其增殖（P<0.001）；鹽酸小檗堿與大鼠主動脈內皮細胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX隨濃度增加而上調（P<0.001）。結論 鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動脈內皮細胞增殖，并上調促凋亡蛋白BAX水平。

[關鍵詞]鹽酸小檗堿；主動脈內皮細胞；增殖；凋亡

鹽酸小檗堿亦稱黃連素，是毛茛科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中的主要成分，屬于異喹啉類生物堿，臨床上多用于抗腸道細菌感染。近年來小檗堿的研究越來越廣泛，包括降糖、降脂、內皮依賴性舒張血管、誘導自噬、神經性疾病的治療等方向。內皮細胞的凋亡即內皮細胞的程序性壞死，誘導內皮細胞凋亡可抑制血管新生導致血管退化。目前，通過抑制腫瘤血管新生治療腫瘤的方式已成為新的研究方向。

1.材料與方法

1.1主要試劑與儀器 鹽酸小檗堿（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS號：633-65-8）：阿拉丁試劑公司：大鼠主動脈內皮細胞株：清華大學醫學實驗室饋贈；PRMI.1640培養基：Gibico公司；噻唑蘭（MrlT）：凱基生物試劑公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP標記的羊抗兔抗體BCA試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；全自動酶標儀Muhiskan MK3：Thermo公司；電泳槽、電泳儀、凝膠成像儀：BIO-RAD。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠主動脈內皮細胞的復蘇、培養 將凍存于液氮的大鼠主動脈內皮細胞解凍、1000轉/分離心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培養基中培養，置于37℃、5%CO2培養箱。當細胞長到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代。在顯微鏡下觀察細胞狀態、形態，選取狀態優良的細胞進行后續體外試驗。

1.2.2MTT法檢測鹽酸小檗堿對大鼠主動脈內皮細胞增殖的影響 對消化的大鼠主動脈內皮細胞進行細胞計數，以1×104細胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后加人不同濃度的鹽酸小檗堿（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每組6個復孔，培養1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培養結束棄上清，避光加人M1Tr溶液（終濃度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養4h，棄細胞上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150uL，于恒溫振蕩箱反應10 min以充分溶解。在全自動酶標儀490 nm處測吸光度OD值。

1.2.3Western Blot檢測BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動脈內皮細胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各組細胞總蛋白，注意冰上操作，以減輕蛋白裂解；使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，酶標儀562 nm處檢測OD值，計算出蛋白的質量。每個樣品加5xSDS 25uL，100℃沸水中變性。分別從每組中取總蛋白25ug制備蛋白上樣，進行12%SDS-PAGE膠電泳，連接正負極，加滿電泳液，開始使用80 V電壓.跑30 min后把電壓改為120 V.樣本繼續跑1 h，直到溴酚藍跑出玻璃板。PVDF膜轉膜，電泳槽置冰上，100 V電壓跑75 min。麗春紅染色并用去離子水清洗，配一抗、二抗稀釋液（水：casein=20：1），抗體濃度為（1：1000），一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL發光液進行發光，通過凝膠成像儀顯影，并用imageJ進行灰度值分析。

1.3統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多個樣本均數比較采用成組設計的單因素方差分析，3個樣本均數兩兩比較的q檢驗（Newman-Keuls法），檢驗水準：a=0.05，雙側檢驗。

2.結果

2.1不同濃度小檗堿在不同干預時間作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預大鼠主動脈內皮細胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法檢測細胞增殖活性結果。由表1、圖1可見，與對照組（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L濃度小檗堿作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h時差異均有統計學意義（P<0.01），提示小檗堿對大鼠主動脈內皮細胞具有抑制增殖活性的作用。不同濃度作用12 h、24 h OD值變化較明顯，且這兩個時間點效果相似，故選取12 h作為最適作用時間。其中各濃度作用1 h、2 h，內皮細胞抑制率低于10%；4 h、8 h內皮細胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h內皮細胞抑制率為31%-62%，其中72小時100umol/L小檗堿作用內皮細胞抑制率可達到62%。

2.2不同濃度鹽酸小檗堿處理后BAX蛋白表達水平 不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動脈內皮細胞24 h后，Western Blot結果如圖2所示?？梢?5umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿促進促凋亡蛋白BAX水平的表達.但是未見濃度依賴性。

3.討論

3.1鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動脈內皮細胞增殖

細胞凋亡可抑制血管新生過程，導致血管退化。本研究主要以不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動脈內皮細胞，觀察其增殖活性及檢測促凋亡蛋白BAx的表達.探討鹽酸小檗堿對內皮細胞凋亡的作用機制，為抑制血管新生過程的研究提供理論基礎。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預大鼠主動脈內皮細胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可見12 h、24 h、48 h、72 h時差異均有統計學意義.提示小檗堿對大鼠主動脈內皮細胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h療效不顯著，可能與藥物在內皮細胞的代謝有關。血管內皮生長因子（VEGF）是腫瘤血管形成最關鍵的生長因子，研究表明，HIF-1A可以誘導VEGF的表達增加，并且可以引起腫瘤組織的微血管密度增加，在腫瘤新生血管形成過程中有著重要的作用。小檗堿不僅可以顯著抑制腫瘤血管增殖，降低胞內ROS水平，而且在維生素E存在時可完全清除腫瘤誘導產生的新生血管，提示了小檗堿具有抑制腫瘤血管形成的特性。

3.2鹽酸小檗堿可上調促凋亡蛋白BAX的表達不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動脈內皮細胞24 h后，Western Blot檢測結果可見25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿促進促凋亡蛋白BAX水平的表達，但是未見濃度依賴性。內皮細胞的凋亡主要與腫瘤壞死因子死亡通路及線粒體途徑通路有關。腫瘤壞死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和絲裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信號途徑。腫瘤壞死因子有調節血管形成的作用.低劑量腫瘤壞死因子能促進內皮細胞形成血管結構：高劑量腫瘤壞死因子能誘導內皮細胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一個促凋亡因子，通過BH3區域識別BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2異二聚體，發揮促凋亡作用。。游離BAX可直接在線粒體膜上形成BAX-BAX同二聚體，改變線粒體膜通透性.使細胞色素C釋放到胞質，激活下游的caspase3協同細胞凋亡。

本實驗發現不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動脈內皮細胞，能抑制其增殖活性及上調促凋亡蛋白BAX的表達，高劑量小檗堿較低劑量小檗堿抑制增殖作用更明顯。