黃芪提取物對老年癡呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表達的影響

單鐵強，單鐵英，高立威，董 洋，鄭秀清，董 靜，鄭海萍，王雪丹，蘇安英

黃芪提取物對老年癡呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表達的影響

單鐵強1，單鐵英2，高立威3，董 洋3，鄭秀清4，董 靜4，鄭海萍2，王雪丹2，蘇安英2

目的 研究黃芪提取物(EA)對老年性癡呆(AD)大鼠核轉錄因子-κB(NF-κB)和NF-κB抑制蛋白(IκB-a)蛋白的影響。方法 大鼠海馬內注射Aβ25-35制備AD大鼠模型，實驗分4組：對照組、模型組、黃芪組和西藥治療組。黃芪組和西藥治療組分別用黃芪提取物和腦復康灌胃，對照組和模型組用等量生理鹽水灌胃。用Morris水迷宮測定各組大鼠的學習記憶能力，Western blot測定各組大鼠海馬NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白表達水平。結果 模型組的逃避潛伏期延長，單位時間內跨越原平臺次數減少，NF-κB和caspase-3蛋白表達升高，而IκB-a蛋白表達降低，與對照組比較均有統計學差異(P<0.01)；黃芪組的逃避潛伏期縮短，單位時間內跨越原平臺次數增多，NF-κB和caspase-3蛋白表達降低，而IκB-a蛋白表達升高，與模型組比較均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，其作用效果與西藥治療組相當(P>0.05)。 結論 黃芪提取物通過提高AD大鼠海馬區IκB-a的含量，使游離NF-κB的含量減少，激活caspase-3受到抑制，從而抑制了神經細胞的凋亡。

阿爾茨海默病；黃芪提取物；核轉錄因子-κB；NF-κB抑制蛋白；caspase-3

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種進行性中樞神經系統功能退行性疾病，也是中老年人常見的一種疾病，病人常表現為認知障礙、智力減退和人格改變，如果得不到有效治療，最終會引起多種并發癥導致死亡。目前其發病機制尚不清楚，也無治療本病的特效藥。本研究采用大鼠雙側海馬注射β-淀粉樣蛋白25-35 (β-amyloid protein25-35，Aβ25-35)建立AD模型，主要探討黃芪提取物(extract of astragalus，EA) 對AD大鼠學習記憶力的影響，檢測大鼠海馬區核轉錄因子-κB (nuekear factor kappa B，NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB-a)和caspase-3蛋白的表達水平，分析EA對AD的學習記憶改善情況，為臨床上預防和治療AD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠購自河北醫科大學動物實驗中心，雄性，月齡為11個月～13個月，體重為359.6 g±16.3 g，共30只。

1.2 儀器與試劑 腦立體定向儀：江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農機廠制造。EA購自合肥市恒星藥物研究所，先用少量<0.2%無水乙醇溶解，再加適量雙蒸水，高壓滅菌，4 ℃備用。

Aβ25-35購自美國Sigma公司，加入適量無菌生理鹽水，配制其濃度為10 g/L，在37 ℃條件下孵育72 h，呈聚集狀態，4 ℃備用。NF-κB、IκB-a和caspase-3抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗分組與AD模型的建立 將大鼠隨機分為4組：對照組、模型組、黃芪組和西藥治療組，每組10只。參照張佳等[1]的方法建立大鼠AD模型，模型組和黃芪組均于雙側海馬CA1區注射Aβ25-35各1 mL(10 mg)，正常對照組則注射等量的生理鹽水。首先，在AD模型建立后的第2天，各組大鼠分別用Morris水迷宮進行測試，以確定AD模型的建立是否成功。然后，黃芪組用EA灌胃，劑量為80 mg/(kg·d)，西藥治療組用吡拉西坦(腦復康)灌胃，劑量為430 mg/(kg·d)，模型組和對照組給予等量生理鹽水。治療時間為18 d。在第19天時，再進行一次時間為5 d的Morris水迷宮測試，次日殺死大鼠取出各組的海馬組織用于Western blot檢測。

1.4 Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力 水迷宮為黑色內壁的圓形水池，直徑120 cm，高55 cm，水深42 cm，距池壁35 cm處放置一圓形站臺，直徑8 cm，高40 cm。實驗共5 d，前1 d先進行2 min的自由游泳以適應環境，以后每天在上午和下午各訓練一段，每段3次，連續訓練4 d。訓練時把大鼠面向池壁隨機放入一個入水點開始計時，在120 s內找到站臺的時間作為潛伏期；若在120 s內未找到站臺則將其引至站臺，潛伏期記為120 s。在第5天進行定位航行實驗，觀察并記錄其上站臺的潛伏期。

上述實驗完成后，大鼠休息3 h，撤去站臺，把大鼠面向池壁在同一入水點放入水中，記錄其在120 s內穿越站臺相應位置的次數。

1.5 Western blot檢測NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白的表達水平 用上樣緩沖液5×SDS與各組大鼠海馬組織總蛋白提取物50 μg均勻混合，100 ℃煮沸5 min，冰上冷卻，加入PAGE凝膠孔內，進行恒壓為120 V電泳。在77 V恒壓和185 mA的條件下分別用45 min將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜，用TTBS 20 mL和1 g奶粉封閉2 h。將膜分別浸入兔抗鼠多克隆抗體NF-κB(1∶250)、IκB-a(1∶300)和caspase-3(1∶250)溶液，4 ℃孵育過夜。TTBS溶液洗膜3次，每次10 min，將膜浸入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液(1∶10 000)，37 ℃孵育2 h，TTBS溶液洗膜3次，每次10 min，化學發光法顯色。

2 結 果

2.1 EA對大鼠學習記憶能力的影響 大鼠模型建立后，在未進行任何處理之前4組模型大鼠進行Morris水迷宮實驗的結果顯示：模型組、黃芪組和西藥治療組的逃避潛伏期均明顯高于對照組，而穿臺次數均明顯低于對照組(見表1)，表明AD模型建立成功。定位航行實驗：隨著訓練天數的增加，各組尋找站臺的潛伏期越來越短，表明4組大鼠通過學習，均可對水下的站臺產生空間定位記憶。在訓練第1天～第4天，模型組大鼠的平均潛伏期明顯大于對照組(P<0.05)；與模型組比較，黃芪組的潛伏期在訓練第3天～第4天均顯著縮短，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，黃芪組與西藥治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

空間探索實驗：與對照組相比，模型組大鼠穿越站臺次數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，黃芪組大鼠穿越站臺次數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，黃芪組與西藥治療組相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表1 各組大鼠學習記憶行為比較(±s)

表2 EA對大鼠學習記憶能力的影響(±s)

2.2 EA物對大鼠海馬NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白表達的影響 Western blot顯示：模型組NF-κB和caspase-3蛋白表達升高，而IκB-a蛋白表達降低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；黃芪組NF-κB和caspase-3蛋白表達降低，而IκB-a蛋白表達升高，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 Western blot檢測海馬組織NF-κB、IκB-a 和caspase-3蛋白表達(n=10)

表3 大鼠海馬組織NF-κB、IκB-a和 caspase-3蛋白表達(±s)

3 討 論

AD的學習和記憶能力減退。Morris水迷宮能夠檢測腦的學習記憶功能，成為診斷和評價AD的重要手段。本研究的水迷宮實驗結果顯示，與對照組相比，模型組的定位航行潛伏期顯著延長，說明Aβ25-35具有神經毒性，造成大鼠學習記憶障礙，經過EA治療后，AD大鼠學習記憶能力得到了明顯提高。

AD中神經細胞的死亡以凋亡為主。NF-κB是細胞凋亡信號通路中一個重要的轉錄調節因子[2-3]。研究表明在AD病人腦組織中退變的神經細胞和星形膠質細胞以及早期老年斑周圍的神經細胞中NF-κB被激活[4-5]，可以推測β-淀粉樣蛋白可能是NF-κB的強激化劑。IκB可以和NF-κB結合形成復合物，抑制NF-κB進入細胞核，在細胞處于靜息狀態時，此復合體無活性，當外界信號刺激細胞后，激活IκB激酶復合體(IκB kinase，IKK)，使IκB磷酸化，NF-κB成為游離狀態進入細胞核內，結合特異性基因序列并誘導其轉錄。caspase-3參與神經細胞的凋亡過程，作為一種剪切酶，使DNA酶激活裂解DNA，最終導致細胞凋亡[6-7]。

本實驗的結果表明：模型組大鼠海馬組織IκB-a的表達顯著減少，caspase-3的表達明顯增加，提示在AD大鼠腦組織中，IκB激酶復合體激活從而使IκB磷酸化，IκB-a與NF-κB分離，磷酸化IκB被降解，造成IκB-a的含量減少；NF-κB成為游離狀態并進入細胞核內，激活了caspase-3的轉錄，使caspase-3表達水平明顯升高。經EA治療后AD大鼠海馬區IκB-a的表達水平明顯升高，而caspase-3表達水平明顯降低，說明EA通過提高AD大鼠腦內IκB-a的含量，使NF-κB與IκB-a結合，抑制NF-κB進入細胞核內，不能使caspase-3的轉錄激活，從而降低了caspase-3表達水平，抑制了神經細胞的凋亡。

綜合上述，EA可能使神經細胞中IκB-a的蛋白表達水平升高，增加NF-κB與IκB-a的結合，使游離狀態的NF-κB減少，抑制其進入細胞核激活caspase-3的轉錄，阻止了其下游caspase-8、caspase-9的活化，從而抑制神經細胞的凋亡。但是EA是如何提高神經細胞中IκB-a的表達水平，其機制還不清楚，尚需進一步的研究。

[1] 張佳，宋立剛，孔衛娜，等.紅景天苷對Aβ1-40所致阿爾茨海默病模型大鼠認知功能改善作用及機制探討[J].中國中藥雜志，2012，37(14)：2122-2126.

[2] 姜波.補陽還五湯膠囊對AD大鼠NF-κB信號調控及對覓形膠質細胞相關蛋白表達影響的實驗研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2010.

[3] 姚麗芬.Aβ1-40誘導癡呆大鼠腦海馬及皮質基因表達譜差異的實驗研究[D].長春：吉林大學，2005.

[4] 孫建英，關新華，張秀清，等.兩種給藥途徑致癇大鼠海馬神經元超微結構損傷及caspase3的表達特征[J].神經解剖學雜志，2007，23 (6)：565-570.

[5] O’Neill LAJ，Kaltschmidt C.NF-κB：a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function[J].Trends Neurosci，1997，20：252-258.

[6] 劉萍，叢國止，獨軍政，等.細胞凋亡信號傳導通路的研究進究[J].湖北農業科學，2010，49(3)：715-717.

[7] Choi JY，Kim BM，Kim YJ，et al.Hypoxia/reoxygenation-induced cytotoxicity in cultured human lymphocytes [J].Biochem Biophys Res Commun，2007，352(2)：366-371.

(本文編輯郭懷印)

The Influence of Astragalus Extract on the Protein Expression of NF-κB and IκB-a in Rats with Alzheimer’s Disease

Shan Tieqiang，Shan Tieying，Gao Liwei，Dong Yang，Zheng Xiuqing，Dong Jing，Zheng Haiping，Wang Xuedan，Su Anying

Harbor Hospital of Qinhuangdao，Qinhuangdao 066000，Hebei，China

Objective To study the effects of astragalus extract(EA) on the protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) and IκB-a in rats with Alzheimer’s disease (AD).Methods The AD model rats were established by injecting Aβ25-35 into districts of hippocampuses.The rats were divided into 4 groups：control group，model group，EA group，piracetam group.The rats in EA group and piracetam group were treated with EA and piracetam lavage respectively，with isodose physiological saline lavage in control group and model group.The ability of learning and memory was detected by Morris water maze.The protein expression level of NF-κB，IκB-a and caspase-3 in the hippocampus was detected by western blot.Results Compared with control group，the incubation period of avoiding was lengthened，the frequency of passing through platform was decreased，the expression level of NF-κB and caspase-3 was increased，while the expression level of IκB-a was decreased in model group(P<0.05).Compared with the model group，the incubation period of avoiding was obviously shorten，the frequency of passing through platform was increase，the expression level of NF-κB and caspase-3 was decreased，while the expression level of IκB-a was increased in EA group (P<0.05 or P<0.01).Its effect was similar with western medicine treatment group (P>0.05).Conclusion EA can increase the content of IκB-a and decrease the content of free NF-κB in the hippocampus of AD rat，and restrained the activation of caspase-3，inhibit the apoptosis of nerve cells.

astragalus extract；Alzheimer’s disease；nuclear factor-kB；IκB-a；caspase-3

1.河北省秦皇島市海港醫院(河北秦皇島 066000)，E-mail：sty751218@163.com；2.河北工程大學；3.河北省邯鄲市中心醫院；4.河北省邯鄲市疾病預防控制中心

引用信息：單鐵強，單鐵英，高立威，等.黃芪提取物對老年癡呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(7)：802-804.

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.07.010

1672-1349(2017)07-0802-03

2016-11-11)