擬南芥HGO基因啟動子與GUS融合表達載體的構建及轉化鑒定

蔡 薇，支添添，任春梅，2*

（1湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128；2作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128）

擬南芥HGO基因啟動子與GUS融合表達載體的構建及轉化鑒定

蔡 薇1，支添添1，任春梅1，2*

（1湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128；2作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙410128）

HGO基因編碼的尿黑酸1，2雙加氧酶催化酪氨酸降解途徑中的倒數第三步。本研究構建了擬南芥HGO基因啟動子與GUS的融合表達載體，采用農桿菌介導法轉化擬南芥獲得轉基因株系。經GUS組織化學染色鑒定，證明擬南芥HGO基因啟動子與GUS的融合表達載體成功構建且能正常啟動GUS基因的表達，為深入研究擬南芥HGO基因的表達特征創建了有價值的材料。

擬南芥；HGO；啟動子；同源重組；基因克隆

酪氨酸降解途徑在動物體內是必不可少的一條代謝途徑［1］，尿黑酸1，2雙加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）是酪氨酸降解途徑中倒數第三步，可將尿黑酸氧化分解成馬來酰乙酰乙酸，再經馬來酰乙酰乙酸異構酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸，最后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸進入三羧酸循環徹底分解［2］。在動物中，HGO基因是不可缺少的，HGO的缺失會導致尿黑酸血癥［3］。在植物中，除發現HGO基因突變可以促進擬南芥幼苗的生長［4］外，無其他研究成果。

本試驗以模式植物擬南芥為材料，構建了HGO基因啟動子與GUS的融合表達載體，將其轉入擬南芥中，抗性篩選獲得了穩定遺傳的轉基因株系，利用GUS染色檢測到擬南芥HGO基因啟動子成功轉入植株內且能正常啟動GUS基因的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col-0和載體pCAMBIA1301由作物基因工程湖南省重點實驗室植物信號傳導課題組保存，ClonExpressⅡ重組試劑盒從Vazyme公司購買。

1.2 植物的培養和生長條件

將擬南芥種子用消毒液（20%bleach＋0.1% Triton100）浸泡10 min后，在超凈臺上用無菌水清洗4～5次，直接播種在含1%蔗糖的MS固體培養基上。4℃黑暗處理3 d后，轉入培養室生長，培養溫度（22±2）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗［5］。待其生長7 d后，移栽到營養土（東北黑土與蛭石的體積比為1∶1）中并蓋上透明塑料蓋培養1～2 d，生長條件同上。

1.3 表達載體的構建

1.3.1 設計引物及目的片段的擴增

在TAIR網站上找到已公布的擬南芥HGO基因啟動子序列，經plantcare在線分析軟件分析后選取ATG前2000 bp序列，運用引物設計軟件Primer Premier5設計特異性引物PstⅠ-F/NcoⅠ-R。因所選表達載體需含有GUS報告基因，而所有含GUS報告基因的載體在35S啟動子下游都只含NcoⅠ和BglⅡ這兩個可選限制性酶切位點，BglⅡ酶切位點包含在GUS基因內，而NcoⅠ與目的基因中存在同源序列。針對這一問題采用同源重組法構建載體，先將載體線性化，選取兩個限制性內切酶PstⅠ和NcoⅠ對載體進行雙酶切。因此需要在引物5′端引入線性化載體末端同源序列，使得插入片段擴增產物5′和3′最末端分別帶有和線性化載體兩末端對應的完全一致的序列［6］，引物為：

下劃線部分為酶切位點，5′端前端為入線性化載體末端同源序列。根據引物合成時預測的退火溫度，選用67℃為PstⅠ-F/NcoⅠ-R退火溫度。用SDS法［7］提取擬南芥Col-0野生型葉片基因組DNA，以此為模板用高保真酶進行PCR擴增。擴增后的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收并純化。

1.3.2 擬南芥HGO基因與GUS融合載體的重組及鑒定

選用PstⅠ和NcoⅠ限制性內切酶將pCAMBIA1301載體線性化（載體線性化方式可以為限制性內切酶酶切消化，也可以為反向PCR擴增）。利用ClonExpressⅡ試劑盒進行重組反應。體系為5 ×CEⅡBuffer 4μL，線性化載體8μL，插入片段擴增產物1μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 5μL。將配置好的體系置于37℃反應30 min，反應完后將反應管立即置于冰上冷卻5 min。將20μL冷卻反應液，加入到200μL的感受態中，輕彈管壁混勻，在冰上放置30 min。42℃熱激60～90 s，冰水浴孵育2 min。加入900μL LB液體培養基，37℃孵育10 min充分復蘇。37℃150 rmp搖菌45 min。6000 g離心2 min，去部分上清液，將其充分混勻，取100μL混勻后的菌液涂布在含有50 mg/L kan的LB培養基上。37℃倒置過夜培養［8～11］。取陽性克隆送華大基因公司測序。采用電擊法將測序驗證正確的重組載體質粒轉化到根癌農桿菌GV3101中，挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定。

1.3.3 擬南芥的遺傳轉化及篩選

挑選菌落PCR驗證正確的農桿菌單菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的YEB液體培養基里進行活化處理，28℃、220 rpm振蕩培養18～24 h。6000 g離心大量活化菌液2 min，棄上清，用農桿菌懸浮液（5%蔗糖＋1/2 MS＋0.02%Silwet-L77＋0.01%6-BA）將菌體重懸至OD600在0.6～1.0之間。利用浸花法［12］轉化擬南芥，收取T0代種子，在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培養基上篩選成功轉入pHGO：：GUS表達載體的轉基因植株，進一步采用PCR進行植株鑒定，用GUS組織化學法檢測啟動子活性。

2 結果與分析

2.1 擬南芥HGO基因啟動子的克隆

根據已知的序列信息，設計帶特異酶切位點的引物，擴增引物分別含PstⅠ和NcoI的酶切位點，以擬南芥Col-0野生型基因組DNA為模板，采用高保真酶進行PCR擴增，PCR產物預期大小為2002 bp。將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果表明擴增產物符合預期大小（圖1）。這表明PstⅠ-F和NcoⅠ-R能成功擴增出目的片段。

圖1 HGO基因啟動子PCR擴增結果Fig.1 PCR result of HGO promoter

2.2 pHGO∶∶GUS融合表達載體的構建

將PCR產物和線性化載體用ClonExpressⅡ試劑盒重組，構建重組后產物采用熱激法轉入大腸桿菌E.coli DH5α，隨機挑選單菌落進行PCR檢測（圖2）。菌落PCR擴增產物大小在2000 bp左右，與預期結果一致。2號泳道加入的模板為水，此泳道沒有出現條帶，說明PCR體系沒有DNA污染；3～6號泳道條帶大小均在2000 bp左右，與預期大小相似。選取條帶最亮的6號大腸桿菌擴大培養后提取質粒送至上海博尚生物技術有限公司進行測序鑒定。測序結果顯示：6號菌種插入片段大小為2002 bp，經過DNAMAN軟件序列比對分析，發現目的基因與GUS之間的結合位點與預期一致，且沒有移碼亂碼現象，這表明pHGO∶∶GUS融合表達載體（圖3）成功構建。

圖2 融合表達載體轉化E.coli DH5α后的菌落PCR檢測Fig.2 PCR result of fusion expression vector was transformed into E.coli DH5α

圖3 pHGO∶∶GUS融合表達載體示意圖Fig.3 Schematic diagram of pHGO∶∶GUS vector

2.3 pHGO∶∶GUS融合表達載體的遺傳轉化及鑒定

將pHGO∶∶GUS重組表達載體通過電擊法轉入根癌農桿菌GV3101中，并通過農桿菌介導的浸花法轉化模式植物擬南芥，進行融合基因的穩定表達實驗。融合表達載體具有潮霉素抗性，將浸染后當代成熟的種子鋪種在MS培養基上春化后在長日照下生長，具有潮霉素抗性的植株正常生長。將抗性苗移栽至人工土壤中，簡易SDS法提取潮霉素抗性植株基因組DNA，以引物對pC1301-F/pC1301-R進行特異性擴增，引物為：

結果表明，大部分潮霉素抗性植株能產生特異擴增帶（圖4），說明融合表達載體已成功整合到擬南芥基因組中。

圖4 轉基因擬南芥植株的PCR檢測Fig.4 Result of genetic transformation

2.4 轉基因植株GUS檢測

為了檢測轉基因植株中的HGO啟動子是否具有活性，隨機挑選具潮霉素抗性和PCR陽性的T2代轉基因擬南芥進行報告基因的檢測。將檢測植株的種子鋪種在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培養基上，置于長日照（16 h光照/8 h黑暗）下培養7～9 d，取無菌苗進行GUS組織化學法檢測，通過實體顯微鏡觀察染色結果。結果表明：轉入pCAMBIA1301質粒（含35S啟動子）的陽性對照（圖5A）幼苗中，GUS基因在根、下胚軸、葉中都高度表達；轉入擬南芥HGO基因啟動子與GUS融合表達載體的轉基因植株幼苗（圖5B），GUS基因在根、下胚軸及子葉中表達較強，在真葉中的表達較弱；而GUS基因未在陰性對照幼苗中表達（圖5C）。

3 結論與討論

在構建表達載體時，需要精心選擇酶切位點及標記基因。當目的基因中含有較多的常用酶切位點時，不得不選擇酶切效率低、價格昂貴的非常用限制性內切酶或構建中間載體，這樣會大幅度降低實驗成功率。本研究中因目的基因內含較多常用酶切位點，所以選用了Vazyme公司ClonExpressⅡ重組試劑盒，此試劑盒采用同源重組的原理，不受酶切位點的限制，降低了載體的局限性。

本研究成功構建了擬南芥HGO基因啟動子與GUS載體的融合表達載體，經過電泳及測序檢測，證實目的片段與pCAMBIA1301在預測位點重組且插入片段無錯配現象，大小正確。對擬南芥遺傳轉化后代進行篩選，在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培養基上獲得抗性苗，GUS染色結果表明，擬南芥HGO基因啟動子成功轉入植株中且能正常啟動GUS基因的表達，為深入研究擬南芥HGO基因的表達特征創建了有價值的材料。

GUS染色結果顯示，擬南芥HGO基因啟動子轉入擬南芥，在根、下胚軸和子葉中表達較強，在真葉中表達較弱，表明在根、下胚軸和子葉中酪氨酸的積累較多，酪氨酸降解途徑較活躍；而真葉中酪氨酸的積累較少，酪氨酸降解途徑較緩慢。這也說明為什么HGO基因的突變使得擬南芥只在幼苗期長勢較野生型更為健碩。因生命活動或功能的不同需求，同種物質在擬南芥的不同組織部位有著其特異性的表達，但這特異性的表達還有待進一步研究。

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Cloning and Transformation of the HGO Promoter from Arabidopsis thaliana

CAIWei1，ZHITiantian1，REN Chunmei1，2*
（1 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China）

The HGO gene encodes the1，2-homogentisate dioxygenase，which catalyzes the last third step in the Tyr degradation pathway.In this study，a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana HGO gene promoter and GUSgene was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium-mediated transformation.Results from histochemical GUS assay suggested that fusion expression vector of HGO gene promoter and GUSgene was successfully constructed and it drives the expression of GUSgene successfully.Our results create valuablematerials for studying the expression characteristics of HGO gene in Arabidopsis thaliana.

Arabidopsis thaliana；HGO；promoter；homologous recombination；gene cloning

Q784

A

1001-5280（2017）03-0256-04 DO I：10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2017.03.09

2016- 11- 30

蔡 薇（1992-），女，碩士研究生，Email：416382074＠qq.com。*通信作者：任春梅，教授，博士，主要從事植物分子遺傳學研究，Email：rencm66＠163.com。

國家973計劃前期研究專項（2014CB160308）。