花藥培養(yǎng)在中美水稻雜交新品系選育中的應(yīng)用

余波+李闖+曾生元++景德道+林添資+錢(qián)華飛++周義文++姚維成+孫立亭+杜燦燦++龔紅兵

摘要：以5份中國(guó)稻種質(zhì)資源、2份美國(guó)稻種質(zhì)資源為親本，靈活運(yùn)用單交、回交、花藥培養(yǎng)等育種手段，實(shí)現(xiàn)中美水稻親本之間有利基因的互補(bǔ)、疊加、純合。通過(guò)對(duì)MS培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及其濃度進(jìn)行精量調(diào)整，促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化，提高成苗率，選育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、光溫鈍感廣適性水稻新品系24份，按其株葉形態(tài)分為2類，其中改良型中國(guó)水稻18份，改良型美國(guó)水稻6份。

關(guān)鍵詞：水稻；花藥培養(yǎng)；美國(guó)稻；育種

中圖分類號(hào)：S511.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0065-03

水稻是我國(guó)最主要的糧食作物之一，我國(guó)有50%以上人口以稻米為主食，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，稻谷在糧食中的比重將繼續(xù)增長(zhǎng)。但是，在耕地資源有限的前提下，如何提高水稻單位面積的產(chǎn)量，對(duì)保障我國(guó)的糧食安全具有重要的意義。當(dāng)前，水稻育種中產(chǎn)量長(zhǎng)期停滯不前，品質(zhì)和抗性也有待提高，其中一個(gè)重要的原因在于目前我國(guó)各地的主栽品種基因的遺傳基礎(chǔ)狹隘，育種工作者所選用的雜交親本遺傳差異小，很難使當(dāng)前水稻的發(fā)展更上一個(gè)臺(tái)階。近年，有學(xué)者對(duì)中美兩國(guó)水稻的基因遺傳背景進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)率（遺傳差異）高達(dá)93.65%[1]。因此，推動(dòng)水稻育種的國(guó)際化，使用不同國(guó)家水稻資源尤其是中美水稻材料進(jìn)行雜交[2]，擴(kuò)大雜交親本之間的遺傳差異，充分提高水稻的雜種優(yōu)勢(shì)，對(duì)當(dāng)前的水稻育種乃至世界糧食的安全都有巨大的推動(dòng)作用。

中美水稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雜交后代分離瘋狂且難于穩(wěn)定[3]，育種選擇難度大，如何提高中美水稻雜交的選育效果，加速后代穩(wěn)定是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。花藥培養(yǎng)是一種雙單倍體育種方法，具有提高選擇效率、縮短育種年限、純合目標(biāo)性狀等眾多優(yōu)勢(shì)，通過(guò)花藥培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速穩(wěn)定中美水稻雜交后代。本研究以中美兩國(guó)水稻為親本，靈活運(yùn)用單交、回交等育種手段，實(shí)現(xiàn)中美水稻親本之間有利性狀的互補(bǔ)、疊加；借助花藥培養(yǎng)技術(shù)快速穩(wěn)定目標(biāo)性狀，實(shí)現(xiàn)中美水稻優(yōu)良基因的聚合。

1材料與方法

1.1材料

中國(guó)稻種質(zhì)資源5份：鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻16號(hào)、鎮(zhèn)稻18號(hào)、嘉禾218、H6/511；美國(guó)稻種質(zhì)資源2份：DG9911772、P1002。

1.2方法

通過(guò)中國(guó)水稻與美國(guó)水稻單交、回交，取BC1F1、BC1F1′、F2稻穗進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，一方面選育適宜在中國(guó)種植的具有優(yōu)質(zhì)、高光效、光溫鈍感、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的中國(guó)水稻品系，另一方面選育適宜在美國(guó)生長(zhǎng)的結(jié)實(shí)率高、單產(chǎn)高的美國(guó)水稻品系。

2中美水稻選育流程

以下以鎮(zhèn)稻88與DG9911772雜交選育為例，結(jié)合圖1、表1說(shuō)明中美2種類型水稻新品系的選育流程。

（1）中美水稻雜交配組：使用江蘇品種鎮(zhèn)稻88，美國(guó)水稻資源材料DG9911772進(jìn)行雜交配組F1代。

（2） 將步驟（1）中得到的F1代分別與鎮(zhèn)稻88和美國(guó)稻資源材料DG9911772回交得到BC1F1、BC1F1′，再?gòu)腂C1F1、BC1F1′中選單株分別進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，選育具有優(yōu)質(zhì)、高光效、光溫鈍感、綜合農(nóng)藝性狀傾鎮(zhèn)稻88的改良型單株，選育具有結(jié)實(shí)率高、單產(chǎn)高的傾DG9911772的改良型單株。

（3） 從F2中選綜合農(nóng)藝性狀傾鎮(zhèn)稻88、DG9911772單株分別進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，根據(jù)需要選育具有優(yōu)質(zhì)、高光效、光溫鈍感、綜合農(nóng)藝性狀傾鎮(zhèn)稻88的改良型單株；選育結(jié)實(shí)率高、單產(chǎn)高的傾DG9911772改良型單株，具有優(yōu)勢(shì)性狀但還需要改良的中間材料分別與鎮(zhèn)稻88和美國(guó)水稻DG9911772雜交，再利用花藥培養(yǎng)加速穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的

改良。

（4）品系鑒定篩選：綜合考慮產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、光溫反應(yīng)等性狀，選出最優(yōu)品系進(jìn)行優(yōu)勢(shì)鑒定。

3花藥培養(yǎng)流程

由于中美水稻基因遺傳背景的差異，花藥培養(yǎng)使用三步成苗法，對(duì)誘導(dǎo)、分化、生根3個(gè)不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)成分及濃度進(jìn)行精量調(diào)整，促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化，提高成苗率。

3.1改良型MS培養(yǎng)基成分

3.1.1供試水稻材料花藥培養(yǎng)所用培養(yǎng)基母液按10倍濃度計(jì)算，母液A（大量元素）包括如下組分：KNO3 30 g/L、NH4NO3 16.5 g/L、KH2PO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 3.7 g/L、CaCl2 4.4 g/L。按100倍濃度計(jì)算，母液B（微量元素）包括如下組分：ZnSO4·7H2O 500 mg/L、MnSO4·H2O 1 000 mg/L、H3BO3 500 mg/L、CuSO4·5H2O 2.5 mg/L、KI 83 mg/L、Na2MoO4·2H2O 25 mg/L、CoCl2·6H2O 2.5 mg/L。按100倍濃度計(jì)算，母液C（鐵鹽）包括如下組分：Na2-EDTA 5.6 g/L、Fe2（SO4）3·7H2O 4.3 g/L。按100倍濃度計(jì)算，母液D（有機(jī)元素）包括如下組分：肌醇10 g/L、煙酸0.05 g/L、鹽酸硫胺素0.05 g/L、鹽酸吡哆醇0.05 g/L、甘氨酸0.2 g/L。

3.1.2供試水稻材料愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基利用上述培養(yǎng)基母液配成1 L誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、濃度為 1 mg/mL 的2，4-D 5 mL、蔗糖40 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白 1 g、山梨糖醇20 g、0.1 mg/mL的玉米素0.8 mL，pH值為58。

3.1.3供試水稻材料愈傷組織分化培養(yǎng)基利用上述培養(yǎng)基母液配成1 L分化培養(yǎng)基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、濃度為 2 mg/mL 的 6-BA 2 mL、濃度為0.5 mg/mL的NAA 0.5 mL、蔗糖30 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g，pH值為5.8。

3.1.4供試水稻材料生根培養(yǎng)基利用上述培養(yǎng)基母液配成1 L的生根培養(yǎng)基，包括如下組分：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、蔗糖30 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g、多效唑2 mg，pH值為5.8。

3.2花藥接種方法

3.2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)取孕穗期劍葉葉枕距3～5 cm的幼穗，在8～12 ℃預(yù)處理8～10 d，消毒；取花粉處于單核時(shí)期的花藥接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)；接種結(jié)束后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，關(guān)閉培養(yǎng)箱中燈管，并用報(bào)紙或黑布遮蓋培養(yǎng)箱透光處，防止外界光線射入，設(shè)定箱內(nèi)溫度為 24～27 ℃，進(jìn)行為期22～35 d的暗處理，形成愈傷組織。

3.2.2分化培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，將分化培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度為24～27 ℃，設(shè)定光照時(shí)間為14 h/d，暗處理時(shí)間10 h/d。

3.2.3生根培養(yǎng)愈傷組織在分化培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)16 d左右分化形成根和芽，長(zhǎng)出綠色小苗，將綠色小苗從分化培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上；將生根培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度為27 ℃，設(shè)定光照時(shí)間為14 h/d，暗處理時(shí)間 10 h/d。

3.2.4煉苗移植綠色小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，所有試管苗均開(kāi)始發(fā)根，當(dāng)試管苗綠苗長(zhǎng)至6～8 cm，具有6～10條長(zhǎng)0.5～1.0 cm的根時(shí)，從試管中取出綠苗，洗去根部培養(yǎng)基，清水培養(yǎng)；隔日移栽至花培苗圃中事先做好的秧田里，使用遮陽(yáng)網(wǎng)遮蓋；1周后移種大田。

3.3花培苗選育

綜合考慮產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、光溫反應(yīng)性，選出最優(yōu)株系，次年進(jìn)行鑒定篩選。通過(guò)2種美國(guó)水稻與5種中國(guó)水稻單交、回交、花藥培養(yǎng)，共篩選出改良型株系24份（表2），按其株葉形態(tài)分為2類，其中改良型中國(guó)水稻18份，改良型美國(guó)水稻6份。

4討論

4.1中美水稻雜交育種的優(yōu)點(diǎn)

（1）有利于拓寬雙親的遺傳距離，提高有利性狀的遺傳效應(yīng)。借助單交、回交、聚合育種逐步實(shí)現(xiàn)中美優(yōu)良性狀（基因）的互補(bǔ)，無(wú)論是用我國(guó)的秈稻還是粳稻與美國(guó)水稻雜交，產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等有利性狀都得到極大提高。

（2）雙親親和性好[4-5]，容易實(shí)現(xiàn)品種間雜交。由于仍然屬于亞種內(nèi)雜交，中美水稻之間雜交表現(xiàn)出較好的親和性，如本研究中所用2個(gè)美國(guó)水稻（P1002、DG9911772）同5個(gè)中國(guó)水稻（鎮(zhèn)稻88、 鎮(zhèn)稻16號(hào)、鎮(zhèn)稻18號(hào)、嘉禾218、H6/511）雜交，F(xiàn)1結(jié)實(shí)率都在70%以上。

（3）有利于品質(zhì)改良、選育穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)品種[6]。美國(guó)水稻所攜帶的優(yōu)質(zhì)基因不同于中國(guó)水稻品種，其優(yōu)質(zhì)性狀受光

溫條件影響小，如P1002、DG9911772在江蘇種植和在海南種植其品質(zhì)性狀（尤其是堊白）均表現(xiàn)同一水平的優(yōu)質(zhì)，利用美國(guó)水稻這一特性，可使我國(guó)水稻的品質(zhì)得以進(jìn)一步改良，實(shí)現(xiàn)中美水稻優(yōu)中選優(yōu)。

（4）有利于培育光溫鈍感性品種，提高品種適應(yīng)性。從表3可以看出，2個(gè)美國(guó)水稻材料分別在江蘇句容與海南陵水種植，播種到齊穗所用時(shí)間僅相差3～6 d，表現(xiàn)為光溫鈍感；而中國(guó)水稻對(duì)光溫條件表現(xiàn)為敏感，在江蘇句容與海南陵水種植，播種到齊穗所用時(shí)間相差14～26 d。利用美國(guó)水稻對(duì)光溫鈍感這一特性，可以培育我國(guó)的光溫鈍感性品種，提高我國(guó)水稻品種的適應(yīng)性。

（5）有利于培育綜合性狀優(yōu)良的水稻新品系。美國(guó)水稻還具有抗倒伏性好[7-8]、葉片厚、對(duì)強(qiáng)光適應(yīng)性強(qiáng)、光合效率高、成穗率高等優(yōu)點(diǎn)，是改良我國(guó)水稻品種的理想材料。

4.2MS培養(yǎng)基改良效果

（1）同MS培養(yǎng)基相比，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中添加了水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇這2種成分。水解酪蛋白（CH）是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，能提高誘導(dǎo)分化效率；山梨糖醇能夠改善愈傷組織的質(zhì)量，使綠苗分化率顯著提高。

（2）同MS培養(yǎng)基相比，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了玉米素。玉米素在與植物激素2.4-D混用的條件下，能快速促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)。

（3）同MS培養(yǎng)基相比，在分化培養(yǎng)基中添加了NAA。NAA在與植物激素6-BA混用的條件下，可以快速促進(jìn)愈傷組織的分化。

（4）同MS培養(yǎng)基相比，在生根培養(yǎng)基中添加了2 mg/L多效唑。可以克服組織培養(yǎng)中試管苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，根系不發(fā)達(dá)的缺點(diǎn)，降低苗高，促進(jìn)根系發(fā)育，健壯幼苗，提高移栽后成活率。

（5）使用三步成苗法，對(duì)誘導(dǎo)、分化、生根3個(gè)不同發(fā)育

階段的營(yíng)養(yǎng)成分及其濃度進(jìn)行精量調(diào)整，更加有利于愈傷組織的誘導(dǎo)、分化，花藥培養(yǎng)成苗、壯苗。

4.3花藥培養(yǎng)在中美水稻育種中的意義

（1）有利于育種材料純合，縮短育種年限。中美水稻之間遺傳差異巨大，后代分離瘋狂且難于穩(wěn)定，花藥培養(yǎng)是一種實(shí)現(xiàn)育種材料快速穩(wěn)定的技術(shù)，借助花藥培養(yǎng)的雙單倍體育種技術(shù)，可以快速穩(wěn)定育種材料。

（2） 有利于排除同一基因位點(diǎn)內(nèi)的顯性效應(yīng)對(duì)后代選育的干擾，提高選擇效率。由于花藥培養(yǎng)所得到的組培苗是通過(guò)單倍體加倍形成的，其后代全部是純合的基因型，排除了基因位點(diǎn)內(nèi)的顯性效應(yīng)對(duì)后代選育的干擾，使不同基因位點(diǎn)非等位基因之間的加性效應(yīng)、上位性效應(yīng)得以充分表達(dá)，提高了選擇效率。

（3）有利于打破優(yōu)良基因與不良基因之間的連鎖，實(shí)現(xiàn)中美水稻優(yōu)良基因的聚合。中美水稻具有很多優(yōu)良基因，但這些優(yōu)良基因往往與不良基因之間存在著連鎖關(guān)系，通過(guò)花藥培養(yǎng)可以打破優(yōu)良基因與不良基因之間的連鎖，實(shí)現(xiàn)中美水稻優(yōu)良基因的聚合。

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