2株番木瓜根際促生菌的解磷解鉀作用

葉維雁++吳海波++劉惠民++熊智++王櫻潼

摘要：用平板涂布、劃線與固體平板-透明圈法從番木瓜根際土壤中篩選出2株解磷解鉀細菌（PK-1、PK-2）。通過搖瓶培養，測定PK-1、PK-2發酵液中水溶性磷、水溶性鉀含量和磷、鉀總量；分析PK-1、PK-2解磷解鉀能力；對PK-1、PK-2進行分子鑒定。結果表明，PK-1溶解無機磷能力的溶量為1.63 μg/mL，PK-2溶量為 17.26 μg/mL，溶解無機磷能力表現為PK-1﹤PK-2，即PK-2具有更強的解無機磷能力；PK-1溶解有機磷能力的溶量為 8.49 μg/mL，PK-2溶量為2.38 μg/mL，溶解有機磷能力表現為PK-1>PK-2，即PK-1的解有機磷能力更好；PK-1溶解鉀能力的溶量為8.15 μg/mL，PK-2溶量為8.49 μg/mL，溶解鉀能力表現為PK-1﹤PK-2，PK-1 和PK-2的解鉀能力接近。經16S rDNA序列分析，初步鑒定PK-1為腸桿菌屬（Enterobacter），PK-2為芽孢桿菌屬（Bacillus）。供試菌株PK-1和PK-2具有良好的解磷解鉀功能，可為進一步研制專用的番木瓜微生物肥料提供菌種資源和依據。

關鍵詞：番木瓜；根際促生菌；解磷；解鉀；鑒定；腸桿菌層；芽孢桿菌屬

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0247-04

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）指生存于植物根際系統，并能促進或調節植物生長的一類微生物，通常具有固氮、溶磷、解鉀、產生植物激素、分泌抗生素等生理活性[1-4]。目前，研究比較多的是PGPR的解磷、解鉀、固氮功能。磷和鉀是植物生長必需的大量營養元素，而我國土壤中可供植物直接吸收利用的磷、鉀資源有限，在生產實踐中，為了提高作物產量，每年都要向土壤中施入大量的可溶性磷肥和鉀肥，造成土壤板結、地力下降、環境污染、農產品品質下降等問題[5]。PGPR在其生命活動過程中通常能將土壤礦物質中難以被植物吸收的磷、鉀釋放出來，轉化成易溶性的養分，提升有效磷、有效鉀的供應水平，促進植物生長。隨著人們環保意識的日益提高，應用PGPR的解磷解鉀能力促進植物生長及提高其產量越來越受到關注，PGPR作為一種寶貴的資源逐漸成為研究熱點[6]。番木瓜（Carica papaya L.）是熱帶、亞熱帶地區廣泛栽培的多年生常綠大型草本植物，別稱萬壽果、木瓜，果實含有豐富的糖類、胡蘿卜素、木瓜酶，富含鈣、磷、鉀等礦物質，還具有清除自由基、增強人體免疫力、抗病原體等保健作用[7-8]。目前，PGPR解磷解鉀作用在許多作物上的應用已得到諸多報道，但在番木瓜上的應用卻鮮有報道。因此，開展番木瓜PGPR菌株解磷解鉀能力的研究，對研制新型微生物肥料以提高番木瓜的產量和質量具有重要的現實意義。

本研究從番木瓜根際土壤中篩選出2株PGPR，并對其解磷解鉀作用進行分析，旨在為進一步研究番木瓜PGPR的生態適應性，研制番木瓜的微生物肥料提供理論依據。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

所用儀器主要有超凈工作臺、電熱恒溫鼓風干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養振蕩器、原子吸收分光光度計、紫外-可見分光光度計、高速冷凍離心機、電子分析天平、純水機、恒溫水浴鍋、多功能梯度PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、微波爐、乙醇燈、1 L移液器；所用試劑主要有瓊脂、瓊脂糖、蛋白胨、酵母浸出汁、牛肉膏、氯化鈉、葡萄糖、2×Taq PCR MasterMix。

1.2土樣

采自云南省西雙版納州普文鎮的番木瓜地，土壤系番木瓜的根際土壤。

1.3培養基

1.3.1菌株分離純化培養基菌株的分離純化采用牛肉膏蛋白胨培養基（NA）。

1.3.2解無機磷培養基（1）解無機磷固體培養基：葡萄糖1000 g，Ca3（PO4）2 5.00 g，MgCl2 5.00 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.20 g，（NH4）2SO4 0.10 g，瓊脂15.00 g，溶于去離子水中，加熱溶化，混勻，加去離子水定容至1 L，調pH值為7.4，分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，分裝。（2）解無機磷液體培養基：除缺少瓊脂外，其他物質含量與解無機磷固體培養基相同。

1.3.3解有機磷培養基解有機磷固體培養基：

（1）蒙金娜基礎培養基。葡萄糖10.00 g、（NH4）2SO4 050 g、MgSO4·7H2O 0.30 g、NaCl 0.30 g、KCl 0.30 g、FeSO4·7H2O 0.36 g、MnSO4·H2O 0.03 g、CaCO3 500 g、瓊脂15.00 g，溶于去離子水中，加熱溶化，混勻，加去離子水定容至1.00 L，調pH值至7.4，分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃ 滅菌20 min，分裝。

（2）卵黃稀釋液。用乙醇擦凈雞蛋外殼，用解剖刀切破雞蛋兩端，流去蛋清后將蛋黃流入已滅菌的錐形瓶中，約加入等量的無菌水，搖勻。

（3）將蒙金娜基礎培養基熔化，冷卻至50 ℃后，立即加入卵黃液，每100 mL基礎培養基加卵黃稀釋液3～4 mL作為有機磷源，混勻后分裝于培養皿內凝成平板。

解有機磷液體培養基：除缺少瓊脂外，其他物質含量與解有機磷固體培養基相同。

1.3.4解鉀培養基（1）解鉀固體培養基：蔗糖10.0 g，酵母膏0.5 g，（NH4）2SO4 1.0 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 1.0 g，鉀長石粉10.0 g，瓊脂15.0 g，溶于去離子水中，加熱溶化，混勻，加去離子水定容至1.0 L，調pH值至7.4，分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，分裝。（2）解鉀液體培養基：除缺少瓊脂外，其他物質含量與解鉀固體培養基相同。

1.4分離及純化菌株

取番木瓜根，用無菌去離子水輕柔沖洗，以去除外圍土壤，用刷子刷取番木瓜根際土1 g，加入裝有100 mL無菌去離子水和若干玻璃珠的錐形瓶中，150 r/min混合30 min，使根際土壤中的微生物細胞充分分散，制作根際土混合液。將根際土混合液梯度稀釋后，分別從10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度中吸取100 μL稀釋液涂布于NA固體培養基上，設3個重復。于37 ℃恒溫培養箱內培養，根據菌落顏色、形狀、大小等特征，觀察并挑取不同的單菌落在NA培養基上劃線純化，連續3～5次劃線，獲取純化的菌株，4 ℃斜面保存，備用。

1.5解磷能力的測定

1.5.1解磷能力的平板測定（1）解無機磷：將活化好的菌株點接于解無機磷固體培養基平板上，于37 ℃恒溫培養箱中培養7 d，觀察透明圈的產生情況，并測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），根據D/d值大小確定解無機磷能力的大小[9]。 （2）解有機磷：與解無機磷能力平板測定方法相同。

1.5.2解磷能力的搖瓶測定解無機磷：（1）種子液制備。菌株經平板劃線活化后，挑取1環接入40 mL NA液體培養基中，以不接菌的NA培養基為對照，37 ℃、150 r/min恒溫搖床培養2～4 d，制備菌液。用分光光度計測定各菌液的吸光度（600 nm），最后用無菌去離子水將各菌液稀釋成相同吸光度作為種子液。（2）發酵液制備。按40 mL解無機磷液體培養基接入1 mL種子液接入菌種，同時接入（1）中的NA培養基 1 mL 作為對照，發酵液及對照在37 ℃、150 r/min條件下培養7 d。（3）發酵液處理。發酵液在冷凍離心機下以 8 000 r/min 的轉速離心15 min后取上清液2 mL移至50 mL容量瓶中，用鉬銻抗比色法[10]測定發酵液中可溶性磷含量。細菌溶解無機磷的量=發酵液可溶性磷含量-對照培養液可溶性磷含量。

發酵液靜置30 min，磷酸鈣沉底后，移取2 mL上清液至50 mL錐形瓶中，加H2O2溶液0.5 mL，微波爐加熱消解，沸騰后改用小火維持，濃縮至1～2 mL后關閉微波爐用余熱將溶液蒸干，以除掉過量的H2O2溶液，冷卻，用5 mL去離子水沖洗錐形瓶內壁，加濃硫酸2滴（約0.1 mL），搖勻后小心轉動錐形瓶，使酸液同內壁接觸，然后加熱1～2 min，使殘渣溶解，溶液剩3～4 mL并冷卻后，轉入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至50 mL作為待測液。按上述步驟處理對照。待測液8 000 r/min離心15 min，取上清液，用鉬銻抗比色法測定發酵液中全磷含量。

解有機磷：與解無機磷能力的搖瓶測定方法相同。

細菌溶解有機磷的量=發酵液可溶性磷含量-對照培養液可溶性磷含量。

1.6解鉀能力的測定

1.6.1解鉀能力的平板測定將活化好的菌株點接于解鉀固體培養基平板上，于37 ℃恒溫培養箱中培養7 d，觀察透明圈的產生情況，并測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），根據D/d值大小確定菌株的解鉀能力。

1.6.2解鉀能力的搖瓶測定（1）種子液制備。菌種經平板劃線活化后，挑取1環接入40 mL NA培養基中，以不接菌的NA培養基為對照，37 ℃、150 r/min恒溫搖床培養2～4 d，制備菌液。用分光光度計測定各菌液的吸光度（600 nm），最后用無菌去離子水將各菌液稀釋成相同吸光度為種子液。（2）發酵液制備。按35 mL解鉀液體培養基接入1 mL種子液接入菌種，同時接入（1）中的NA培養基1 mL作為對照，發酵液及對照在37 ℃、150 r/min條件下培養7 d。（3）發酵液處理。發酵液在冷凍離心機下以8 000 r/min的轉速離心 8 min，取上清液5 mL用去離子水稀釋8倍，使用原子吸收分光光度計測定有效鉀濃度。

細菌溶解鉀的量=發酵液可溶性鉀含量-對照培養液可溶性鉀含量。

發酵液靜置30 min，鉀長石粉沉底后，移取5 mL上清液至50 mL錐形瓶中，加H2O2 溶液1.5 mL，微波爐加熱消解，沸騰后改用小火維持，濃縮至3 mL后關閉微波爐用余熱將溶液蒸干，以除掉過量的H2O2溶液，冷卻，用15 mL去離子水沖洗錐形瓶內壁，加濃硫酸5滴（約0.25 mL），搖勻后小心轉動錐形瓶，使酸液同內壁接觸，然后加熱1～2 min，使殘渣溶解，溶液剩6～8 mL并冷卻后，轉入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至50 mL作為待測液。按上述步驟處理對照。待測液8 000 r/min離心8 min后，取上清液，用原子吸收分光光度計測定發酵液中全鉀含量。

1.716S rDNA基因序列分析

斜面保存的菌株經NA液體培養基搖菌活化后使用離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取細菌基因組DNA，保存于-20 ℃冰箱內。以總DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物[11]進行PCR，擴增16S rDNA近乎全長片段。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR采用50 μL反應體系：2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL，10 μmol/L引物各2.5 μL，DNA模板1.0 μL（20 ng左右），滅菌去離子水補足至50.0 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃復性1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸 5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。根據測序所得16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列。通過MEGA 6軟件，以鄰接法（Neighbour-Joining）構建系統發育進化樹，Bootstrap 值為1 000[12]。

2結果與分析

2.1解磷解鉀的平板測定

從云南省西雙版納州普文鎮的番木瓜根際土壤里篩選得到2株解磷解鉀細菌，編號為PK-1和PK-2。通過固體平板法，根據透明圈直徑D與菌落直徑d的比值，即D/d值的大小初步測定菌株PK-1和PK-2的解磷解鉀能力。由表1可知，菌株PK-1和PK-2在解有機磷與解鉀能力方面都存在一定的差異。解有機磷方面，PK-1和PK-2的透明圈直徑都超過了12.00 mm，PK-1的D/d值達到3.48，大于 PK-2 的1.46，說明PK-1的解有機磷能力較強；解鉀方面，PK-1與PK-2的透明圈直徑都超過了21.00 mm，PK-2的D/d值達到1.65，大于PK-1的1.26，說明PK-2的解鉀能力強于PK-1；解無機磷方面，PK-1和PK-2均未出現透明圈。

2.2解磷解鉀的搖瓶測定

對菌株PK-1和PK-2進行7 d的解磷解鉀搖瓶培養后測得發酵液中無機磷全磷與可溶性磷含量、有機磷全磷與可溶性磷含量及全鉀與可溶性鉀含量（表2）。由表2可知，菌株PK-1和PK-2對無機磷、有機磷和鉀都表現出不同的降解作用。解無機磷（磷酸鈣）方面，PK-1和PK-2發酵液中全磷的質量濃度分別為4.30、43.65 μg/mL，同時PK-1和PK-2的解磷量分別為1.63、17.26 μg/mL，說明PK-2解無機磷的能力明顯強于PK-1；在解有機磷（卵磷脂）方面，PK-1 和PK-2發酵液中全磷的質量濃度分別為32.41、10.86 μg/mL，同時PK-1和PK-2的解磷量分別為8.49、2.38 μg/mL，說明PK-1對有機磷的溶解能力明顯強于 PK-2，與固體平板法測定的解有機磷能力的結果一致；解鉀方面，PK-1和PK-2發酵液中全鉀的質量濃度分別為954、9.01 μg/mL，同時PK-1和PK-2的解鉀量分別為815、849 μg/mL，說明PK-2的解鉀能力略強于PK-1，與固體平板法測定的解鉀能力的結果一致。

2.316S rDNA基因序列測定及分析

提取的菌株PK-1和PK-2基因組DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，無非特異性條帶，可用作16S rDNA PCR擴增的模板。菌株PK-1和PK-2的16S rDNA PCR 擴增采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果在1 485 bp處有1條明亮的特征條帶，并且無其他非特異性條帶（圖1）。

將菌株PK-1和PK-2的16S rDNA基因測序所得序列，采用Blast進行同源性比較，與GenBank中的核酸數據對比分析，選取同源性較高的代表菌株，以16S rDNA基因序列為基礎，構建系統發育樹。從圖2中可以看出菌株PK-1與腸桿菌屬（Enterobacter）的細菌自然聚為1支，它的16S rDNA序列與河生腸桿菌[Enterobacter amnigenus （JQ063000）]有較高的同源性，相似度達100%，因此可鑒定菌株PK-1為腸桿菌屬。菌株PK-2與芽孢桿菌屬（Bacillus）聚為1群（圖3），它的16S rDNA序列與同溫層芽孢桿菌[Bacillus stratosphericus （KX262677）]有較高的同源性，相似度為100%，因此可將菌株PK-2鑒定為芽孢桿菌屬。

3結論與討論

從云南省西雙版納州普文鎮番木瓜根際土壤中篩選得到2株解磷解鉀細菌PK-1和PK-2，通過平板測定D/d值和搖瓶測定發酵液中的全磷、全鉀含量和可溶性磷、可溶性鉀含量評價其解磷、解鉀能力。在解磷解鉀能力的平板測定試驗中，PK-1解有機磷的D/d值為3.48，大于PK-2的1.46；PK-2解鉀的D/d值為1.65，大于PK-1的1.26；解無機磷平板里PK-1和PK-2均沒有出現透明圈。解磷、解鉀能力的搖瓶測定試驗中PK-2溶解無機磷的量為17.26 μg/mL，明顯高于PK-1的 1.63 μg/mL；PK-1溶解有機磷的量為8.49 μg/mL，明顯高于PK-2的2.38 μg/mL；PK-2溶解鉀的量為8.49 μg/mL，略高于PK-1的8.15 μg/mL。解有機磷和解鉀方面，菌株PK-1和PK-2在搖瓶測定試驗和平板測定試驗中的解磷、解鉀效果基本一致，這進一步驗證了固體平板試驗的結果，說明溶解有機磷的能力為PK-1>PK-2，PK-2溶解鉀的能力大于PK-1但不顯著；解無機磷方面，菌株 PK-1和PK-2在平板測定試驗中均無透明圈出現，但在搖瓶測定試驗中PK-1和PK-2表現出一定的解無機磷

能力（PK-2>PK-1），造成這種現象的原因可能是PK-1和PK-2的菌體在固體和液體環境中解無機磷能力不同，也可能是因為固體平板中磷酸鈣的濃度過大，PK-1和PK-2的菌體溶解了部分磷酸鈣但還不足以形成明顯的透明圈。解磷解鉀細菌在生長過程中能分泌一些物質，并向周圍擴散，使菌落周圍的培養基中磷酸鈣、卵磷脂和鉀長石礦粉溶解呈透明狀，因而固體平板-透明圈法是判定菌株是否具有解磷、解鉀能力的常用方法，適合進行解磷解鉀菌的初篩，但存在一定的局限性，使用搖瓶培養測定能對菌株的解磷、解鉀能力進行量化，更為準確和科學[13-15]。

通過16S rDNA對菌株進行初步鑒定，確定菌株PK-1屬于腸桿菌屬，菌株PK-2屬于芽孢桿菌屬，而腸桿菌屬和芽孢桿菌屬是較常見的解磷細菌和解鉀細菌[16-19]。菌株PK-1和PK-2同時具有較強的解磷、解鉀能力，這是一些其他的植物根際促生菌所不具備的特性，可進一步研發成為番木瓜微生物肥料生產菌種，具有重要的理論意義和實踐價值。關于菌株PK-1和PK-2對番木瓜促生作用及對土壤微環境的影響等有待進一步研究。

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