芒果細菌性黑斑病病菌rep—PCR遺傳多樣性

漆艷香++張賀+蒲金基++張欣++謝藝賢++陸英++喻群芳++張輝強

摘要：采用REP、ERIC和BOX引物對22株從海南、四川、廣西芒果產區采集的芒果細菌性黑斑病菌菌株和1株源自美國菌種保藏中心（ATCC）的標準菌株進行rep-PCR分析，并根據DNA指紋特征，用 NTSYS 軟件進行聚類分析。結果表明，3組引物共擴增出463條帶，其中有302條多態性條帶，多態檢測率為65.23%。綜合分析3組引物組合的指紋圖譜數據，以相似系數0.65為閥值時，供試的23株菌株可以分為A和B 2個遺傳相似組，其中來自四川米易縣的2株菌株與標準菌株ATCC11637聚在A組，而來自海南省、廣西省的所有菌株均聚在B組。取相似系數為087時，A組群又可分為2個亞組，而B組群則進一步分為6個亞組。研究結果表明，芒果細菌性黑斑病菌菌株有豐富的遺傳多態性和較大的遺傳變異，但各遺傳聚類組群菌株來源廣泛，與地理來源及芒果品種均無明顯相關性。

關鍵詞：芒果細菌性黑斑病菌；遺傳多樣性；REP；ERIC；BOX

中圖分類號： S436.67+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0088-04

由野油菜黃單胞桿菌芒果致病變種（Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae，Xcm）引起的芒果細菌性黑斑病是芒果上一種常發性重要病害，該病嚴重影響芒果產量和果品商品價值，是芒果外銷產業的重要限制因子[1-2]。選育抗病品種是防治此病害最經濟和有效的措施，而品種抗性是寄主與病原物相互作用的結果，因此，了解與掌握芒果細菌性黑斑病病原菌的群體分化，可為芒果抗病品種選育提供依據和參考。

重復序列PCR（rep-PCR）主要是基于細菌基因組中重復序列元件（REP、ERIC和BOX等）的保守區域設計引物，通過PCR選擇性擴增不同的基因組區域，揭示病原菌不同種或種下的不同菌株的遺傳變異情況[3-4]。該技術具有分辨率高、快速簡單、重復性好的特點，在國內外已廣泛應用于黃單胞菌屬植物病原細菌的群體遺傳多樣性分析，如柑橘潰瘍病病菌（X. citri subsp. citri）[5-7]、水稻白葉枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）[8-9]、水稻條斑病病菌（X. oryzae pv. oryzicola）[10-11]、紅掌細菌性疫病病菌（X. axonopodis pv.dieffenbachiae）[12-13]和十字花科黑腐病病菌（X. campestris pv. campestris）[14-15]等。

目前，國內對于芒果細菌性黑斑病的研究多集中于檢測鑒定[16-17]與防控[18-20]，有關Xcm遺傳分化等方面的研究報道甚少[21]。本試驗首次對22株從海南省、四川省、廣西省芒果產區分離的Xcm菌株和1株源自美國菌種保藏中心（ATCC）的Xcm標準菌株進行rep-PCR分析，以期揭示我國3省（區）Xcm的遺傳多樣性，為芒果品種合理布局、黑斑病的流行監測及防治提供參考依據。

1材料與方法

1.1供試菌株

Xcm標準菌株ATCC11637由國家質檢總局動植物檢疫檢驗研究所趙文軍博士饋贈；其余22株Xcm菌株由筆者從海南省、四川省、廣西省芒果產區的病組織中分離所得，單菌落經不斷純化、回接及鑒定保存。菌株相關信息如表1所示。

1.2菌株的培養和基因組DNA的制備

將供試菌株接種到NA固體平板培養基上劃線培養，28 ℃ 恒溫培養3 d后，挑取單個菌落于NA液體培養液中，在28 ℃恒溫搖床上培養24 h，直接用于DNA提取或4 ℃保存備用。細菌基因組DNA的提取參考Biomiga公司的試劑盒（Bacterial gDNA kit）說明書進行，-20 ℃保存備用。

1.3rep-PCR

rep-PCR采用REP、ERIC和BOX寡核苷酸引物[3]，REP

引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。

按照文獻[3]中的方法對PCR擴增反應體系和條件進行適當調整，所有擴增反應均在PTC200 PCR儀（MJ RESEARCH）上進行。優化后的反應體系如下：2.5 μL 10×PCR緩沖液（Mg2+ Plus），2 μL dNTP混合物（2.5 mmol/L），各 0.5 μL 上、下游引物（20 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），100 ng模板DNA，無菌超純水補足至25 μL。rep-PCR擴增條件：95 ℃預變性 7 min，30個循環（94 ℃ 1 min，40 ℃退火 1 min，65 ℃延伸 8 min），最后 65 ℃ 延伸15 min。ERIC-PCR和BOX-PCR擴增條件中，除退火溫度分別為52、53 ℃外，其余擴增步驟均同rep-PCR。擴增結束后，取6 μL反應產物在1.5%瓊脂糖膠上進行電泳檢測。

1.4數據分析

參照rep-PCR擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，每1條DNA條帶均為1個分子標記，代表1個引物結合位點。根據各分子標記的遷移率及其有無統計所得位點的二源數據，即有帶記為“1”，無帶記為“0”，制成Excel文件用于聚類分析。使用NTSYS-pc 2.10e軟件按UPGMA繪制聚類圖，并進行菌株的分組分析。

2結果與分析

2.1Xcm基因組DNA的rep-PCR指紋圖譜分析

采用3組引物（REP、ERIC和BOX）對23株Xcm的基因組DNA分別進行PCR擴增，均獲得較清晰的電泳圖譜，分別擴增出1～7、4～12、5～7條分子量不等的DNA條帶，多態性比率分別為100.00%、75.00%、42.86%，片段大小主要集中在100～5 000 bp之間。3組引物對所有供試菌株的基因組DNA共擴增出463條帶，其中多態性條帶302條，多態檢測率為65.23%，初步表明供試病菌種群在DNA水平上變異較大，存在豐富的多態性，且各芒果產區Xcm種群的DNA指紋譜型也表現出明顯差異。如圖1所示，同一地點相同品種相同組織分離出的部分菌株指紋圖譜差異明顯，如DFL1、X6、X16與XCM15～XCM21，MYL2與MYL7，MYF2與MYF5，但也有例外，如XCM15～XCM21；不同地點不同品種不同組織分離出的部分菌株指紋圖譜有較大差異，如MYF5、MYL7與海南省分離株及廣西省分離株。

2.2Xcm基因組DNA的rep-PCR聚類分析

本試驗采用NTSYS-pc 2.1聚類分析軟件SHAN程序估算DNA相似系數，綜合分析了3組引物組合的指紋圖譜數據，用UPGMA方法繪制了23株供試菌株的系統聚類樹狀圖。結果（圖2）表明，以相似系數0.65為閾值時，供試的23株菌株可以分為A和B 2個遺傳相似組，其中B含20個菌株，為主要遺傳組。以相似系數為0.87為閾值時，A組群可分為2個亞組，B組群則可分為6個遺傳亞組，其中B-Ⅰ含11個菌株，為主要遺傳亞組。

如圖2所示，聚類分析結果表明，23株供試菌株在相似系數為0.65時，可以分為A、B 2組，其中A組與B組又各自進一步分為2個和6個亞組。A組由2株來自四川省米易縣的菌株與標準菌株ATCC11637組成，其中ATCC11637與1株來自米易縣的菌株進一步聚成A-Ⅰ亞組，A-Ⅱ亞組只有1株來自米易縣的菌株。B組則由14株來自海南省、5株

來自四川省及1株來自廣西省的菌株組成。B-Ⅰ亞組以6株來自海南省東方市和3株來自海南省三亞市的菌株為主，另外2株菌株則分別來自廣西省田東縣和四川省攀枝花仁和區；B-Ⅱ亞組只有1株來自四川省米易縣的菌株；B-Ⅲ包括來自四川省攀枝花仁和區及海南省東方市的菌株各1株。B-Ⅳ亞組包括2株來自四川省米易縣及1株來自海南省東方市的菌株；B-Ⅴ亞組僅有1株來自海南省東方市的菌株；B-Ⅵ亞組包括2株分別來自四川省米易縣及海南省東方市的菌株。

3討論

應用分子生物學技術分析Xcm群體遺傳結構研究，國外已有相關研究與報道[22-24]。Gagnevin等采用hrp探針對127株Xcm進行了RFLP分析，結果表明供試菌遺傳多樣性豐富，可分為4個組群，且遺傳分化與菌株的寄主及地理來源有明顯的相關性[22]。Kishun等對6株印度Xcm進行RAPD分析，結果證明供試菌株遺傳多樣性較豐富，可劃分為2個組群，組群與供試菌株地理來源沒有相關性[23]。Pruvost等對299株Xcm進行MLVA、IS1595-LM PCR及AFLP分析，結果證明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性，可分別劃分為231、29、125種單倍型，但單倍型的劃分與菌株的地理來源沒有相關性[24]。迄今為止，國內尚未見應用分子生物學技術進行Xcm遺傳分化的研究報道。

本試驗采用REP、ERIC和BOX引物對23株來源于海南省、四川省、廣西省及美國菌種保存中心的Xcm進行了遺傳多樣性的分子指紋分析，結果表明，REP和ERIC引物能擴增出多種條帶，并顯示出多態性豐富的特點，而BOX-PCR雖可擴增出條帶，但用于分析Xcm群體內的遺傳變異的效果不理想。

為了準確反映供試菌株間基因組之間的差異，本試驗綜合分析了3組引物的DNA指紋圖譜，結果表明，供試菌株群體具有豐富的遺傳多樣性，不同地區的部分Xcm菌株DNA指紋譜型具有較明顯的差異，另外，來源于同一縣市的Xcm，其部分菌株的DNA指紋譜型也表現出一定差異。進一步分析發現，來自不同產區與不同芒果品種的Xcm可以聚成一組，由此說明芒果細菌性黑斑病病原菌的遺傳組與地理來源及芒果品種均無明顯相關性，這一研究結果與文獻報道[23-24]一致，這也從側面說明了該病是帶菌苗木、接穗調運引起的。

4結論

本試驗采用rep-PCR指紋分析初步揭示了Xcm基因組間的遺傳多樣性，結果表明，Xcm群體有豐富的遺傳多態性和較大的遺傳變異，且各遺傳聚類組群菌株來源廣泛，與地理來源及芒果品種均無明顯相關性。由于所用的菌株數量有限，其代表程度有一定局限性。在以后的研究中，應該大范圍地收集菌株以研究我國Xcm的群體結構和遺傳多樣性。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.023