試管捕捉實時熒光RT—PCR法同時檢測煙草花葉病毒病和馬鈴薯Y病毒病

任錫毅+劉永翔+黃永會++劉作易

摘要：為建立一套簡單、快速、有效的病毒病檢測方法，避開病毒病檢測中分子生物學方法檢測時RNA提取這一復雜、費時、費力的過程，且能在同一個反應中同時檢測多種病毒病，對我國常見的 2種煙草病毒的外殼蛋白基因部分序列設計引物和TaqMan探針，結合實時熒光逆轉錄PCR（RT-PCR）和試管捕捉RT-PCR法，對實時熒光RT-PCR法加以改進，與雙抗夾心酶聯免疫法（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay，簡稱DAS-ELISA）和試管捕捉RT-PCR法進行比較，并在此基礎上構建多重試管捕捉實時熒光RT-PCR檢測體系。結果首次成功構建能同時檢測煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的多重試管捕捉實時熒光RT-PCR檢測體系。該技術無須提取RNA，包括葉片研磨、捕捉、反轉錄、熒光PCR 擴增等步驟，簡單快捷、省時省力，具有高效性、系統性和經濟簡便性等特點。

關鍵詞：煙草花葉病毒；馬鈴薯Y病毒；實時熒光RT-PCR；檢測

中圖分類號： S435.72文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0096-05

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，簡稱TMV）和馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，簡稱PVY）是侵染煙草的主要病毒病害，在世界范圍內分布廣泛，嚴重影響煙草的產量和質量，造成重大的經濟損失，對煙草生產造成很大威脅[1-2]，尚無有效的防治藥劑，煙葉生產中，多采用截斷傳播途徑進行預防[3]。由于TMV多是通過農事操作等進行傳播，而PVY多以帶毒蚜蟲刺吸煙株進行傳播，要截斷其傳播途徑，必須提前對2種病毒進行有效、快速和準確的診斷和預測預報[4]。目前在對植物病毒進行檢測中，主要方法有生物學測定法、血清學檢測法、電子顯微鏡檢測法、分子生物學檢測方法等[5-6]。生物學植物病毒檢測方法較慢，而且也受到季節和氣候等因素的限制，靈敏度不高，某些病毒因無法找到鑒別寄主而不能運用這種檢測方法。血清學植物病毒檢測方法對操作環境和操作人員的要求都很高，且檢測成本較高，目前常用的血清學檢測方法有酶聯免疫吸附法、快速免疫濾紙法、免疫熒光技術、斑點免疫測定法以及免疫膠體金技術等；應用電子顯微鏡檢測方法檢測之前一定要先了解不同病毒組具備何種形態以及典型病毒的特點，而且檢測的樣品應該含有較高濃度的病毒。目前常用的分子檢測方法有普通逆轉錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱RT-PCR）法、實時熒光RT-PCR法（real time fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction）、試管捕捉RT-PCR（tube capture reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱TC-RT-PCR）法、免疫捕捉RT-PCR（immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱IC-RT-PCR）法。普通RT-PCR、實時熒光RT-PCR、IC-RT-PCR法需要抗原抗體結合，成本高且費時[5-6]。隨著分子生物學檢測技術的發展，實時熒光RT-PCR以高特異性、高靈敏度以及快速等優點，被越來越多地應用于檢測疫病，其原理是在常規PCR的基礎上，加入1條特異性的熒光探針，隨著探針的水解與信號的積累，實現對特異性產物的定性與定量分析，隨著熒光染料技術的發展，實時熒光RT-PCR技術已經可以同時檢測多種樣品，缺點是當大量樣品和幾種樣品復合侵染時，大批量的RNA或DNA的提取不僅工作量大，特別是RNA的提取對操作環境要求較高，費時費力[7-11]。TC-RT-PCR是將離心管與病毒顆粒非特異性結合和反轉錄PCR擴增結合起來的一種病毒檢測和基因克隆的方法，該技術包括葉片研磨、包被、反轉錄、PCR擴增和電泳檢測等步驟，但該方法檢測后期需要凝膠電泳檢測和接觸DNA染料等對人體有害的物質[12-14]。本研究在實時熒光RT-PCR和TC-RT-PCR方法基礎上進行改進，旨在建立一套不需要RNA提取，避開RNA提取這一復雜費時費力的過程，且能在同一個反應中同時檢測多種病毒病的多重試管捕捉實時熒光反轉錄PCR（tube capture real time fluorescent RT-PCR）法，檢測煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒，為大量病毒病樣品和多種病毒病復合侵染的檢測提供一種簡單、快速有效的方法，對危害煙草的病毒進行有效和快速檢測以及預防和控制煙草病毒病都具有一定的理論和現實意義。

1材料與方法

1.1番茄與馬鈴薯病葉

番茄與馬鈴薯病葉采自貴州省主要的產煙區，經貴州省農業生物技術重點實驗室檢測鑒定為陽性的TMV和PVY染病煙葉和TMV與PVY復合侵染的病葉。

1.2主要試劑

rTaq酶、dNTP、莫洛尼（氏）鼠白血病病毒[Moloney murine leukemia virus，簡稱M-MuLV]反轉錄酶、Oligo（dT）18、RNA酶抑制劑購自TaKaRa[寶生物工程（大連）有限公司]。MakerⅡ購自天根生化科技（北京）有限公司，條帶大小依次為100、300、500、700、900、1 200 bp。洗滌緩沖液和樣品提取緩沖液所需藥品均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。TMV雙抗夾心酶聯免疫法的DAS-ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司。

洗滌緩沖液：氯化鉀（KCl）0.2 g、氯化鈉（NaCl）8 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2 g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9 g、吐溫20（Tween-20）500 μL，調節pH值至7.4，加蒸餾水定容至1 000 mL，4 ℃條件下貯存備用。

樣品提取緩沖液：亞硫酸鈉（Na2SO3）1.3 g、聚乙烯基吡咯烷酮（MV24000-4000，簡稱PVP）20 g、疊氮鈉（NaN3）0.2 g、吐溫20（Tween-20）20 mL，溶解于800 mL洗滌緩沖液中，調節pH值至7.4，加洗滌緩沖液定容至1 000 mL，4 ℃條件下貯存備用。

1‰焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，簡稱DEPC）水：將DEPC水用ddH2O稀釋1 000倍，高壓滅菌后備用。

1.3TaqMan探針及相應引物設計

參考GenBank中已報道的TMV和PVY的外殼蛋白基因序列（GenBank登錄號分別為AJ239099和EU719650），按照TaqMan探針和特異性引物的設計原則，實時熒光RT-PCR檢測用的TaqMan探針和相應的擴增引物利用Primer Express 3.0設計，TC-RT-PCR用引物用Primer5.0軟件設計，均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，如表1所示。

1.4方法

1.4.1TMV和PVY煙草病毒病的TC-RT-PCR檢測

1.4.1.1磨樣取0.1 g病葉，按質量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，獲得病毒提取液。

1.4.1.2捕捉取病毒提取液1 00 μL包被0.2 mL PCR管，于37 ℃水浴3 h或4 ℃過夜；PBST洗管3次，DEPC水洗1次。

1.4.1.3反轉錄直接在PCR管中進行反轉錄，向已捕捉抗原的PCR管中同時加入10 μmol/μL病毒反向引物TMVA1/PVYA11.0 μL、1‰DEPC水11.5 μL、5×M-MuLV反轉錄酶緩沖液4 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、0.1 mol/L Oligo（dT）18 1.0 μL，70 ℃水浴預變性10 min處理，然后立即置于冰上冷卻5 min，再加入40 U/μL RNA酶抑制劑0.5 μL、200 U/μL M-MuLV反轉錄酶1.0 μL；經42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min 合成cDNA，在-20 ℃下保存備用。

1.4.1.4PCR 擴增加入10 μmol/μL正反向引物TMVS1&TMVA1/ PVYS1&PVYA1各1.0 μL；再加入10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、5 U/μL Taq酶 0.25 μL、cDNA5 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：94 ℃ 4min；94 ℃ 45s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后，取10 μL PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，經溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上觀察結果。

1.4.2試管捕捉實時熒光RT-PCR檢測TMV和PVY煙草病毒病

1.4.2.1前3個步驟同“1.4.1”節。

1.4.2.2實時熒光PCR采用25 μL PCR反應體系：加入10 μmol/μL正反向引TMVS & TMVA/PVYS & PVYA各1.0 μL；再加入10×PCR 緩沖液2.5μL、2.5mmol/L dNTPs 20 μL、5 U/μL Taq酶0.25 μL、cDNA 5 μL，TaqMan探針 1.5 μL，用ddH2O補足25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。

1.4.3試管捕捉實時熒光RT-PCR法同時檢測TMV和PVY煙草病毒病

1.4.3.1磨樣取0.1 g病葉，按質量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，獲得病毒提取液。

1.4.3.2捕捉按表2分別對同一管中加入TMV和PVY病毒提取液；包被0.2 mL PCR管，在37 ℃水浴3 h或4 ℃過夜；PBST洗管3次，DEPC水洗1次。

1.4.3.3反轉錄向已捕捉抗原的PCR管中同時加入 10 μmol/μL 反向引物TMVA和PVYA各1.0 μL、1‰ DEPC水8.5 μL、5×M-MuLV反轉錄酶緩沖液4 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、0.1 mol/L Oligo（dT）18 1.0 μL、RNA 2 μL，70 ℃ 水浴預變性10 min處理，然后立即置于冰上冷卻 5 min，再加入40 U/μL 的RNasin 0.5 μL、200 U/μL M-MuLV反轉錄酶1.0 μL；經42 ℃、1 h，70 ℃、10 min合成cDNA，在-20 ℃保存備用。

1.4.3.4實時熒光PCR采用25 μLPCR反應體系：同時加入10 μmol/μL正反向引TMVS & TMVA/PVYS & PVYA各1.0 μL；再加入10×PCR Buffer2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.25 μL、cDNA 5 μL，同時加入TMV和PVY的TaqMan探針各1.5 μL，用ddH2O補足 25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。

1.4.4試管捕捉實時熒光RT-PCR法與DAS-ELISA和TC-RT-PCR法的比較取TMV病葉0.1 g，按質量 ∶體積=1 g ∶10 mL加入樣品提取緩沖液，充分研磨，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，獲得病毒提取液，分別在酶聯免疫板內進行DAS-ELISA（參考美國Agdia公司TMV DAS-ELISA檢測試劑盒說明書）試驗。最后結果用ELX-800 UV自動酶標檢測儀在405 nm處測定樣品的D405 nm）、TC-RT-PCR（參照“1.4.1”節）和試管捕捉實時熒光RT-PCR試驗（參照“1.4.2”節），并將粗提液作梯度稀釋：100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 mg/mL；1.000、0.200、0.040、0.008 μg/mL；1.600、0.320、0064 ng/mL，共12個處理，每個梯度取3份，用于DAS-ELISA、TC-RT-PCR和試管捕捉實時熒光 RT-PCR 靈敏度試驗。

2結果與分析

2.1TMV和PVY的TC-RT-PCR檢測結果

試管捕捉時捕獲溫度在35～39 ℃較好，且36～37 ℃最佳，捕獲時間3～5 h均能得到較好的結果；反轉錄時預變性時間在6～8 min都能得到較好的結果，反轉錄時dNTPs濃度在 18 mmol/L 以上，M-MuLV反轉錄酶濃度在140～260 U/μL 時，RNA酶抑制劑濃度在16 U/μL以上，Oligo （dT）18 濃度在 0.09 mol/μL 以上，反向引物濃度在 0.5 μmol/μL 以上，均能得到較好的結果；PCR擴增時rTaq酶濃度在1～3 U/μL均能得到較好結果，dNTPs濃度在 3.75 mmol/μL 以上，正反向引物濃度在 10 μmol/μL 以上，均能得到較好的結果（圖1、圖2）。

2.2TMV和PVY的試管捕捉實時熒光RT-PCR檢測結果

由圖3、圖4可知，當檢測結果呈陽性時，曲線呈“S”形，而陰性對照呈水平直線，根據TMV和PVY的保守序列設計引物和 TaqMan 探針，分別以帶有TMV和PVY的煙草病毒病樣品作為檢測對象，可以特異性地擴增目的條帶（循環閾值分別為17.71、21.82 ），而對健康的樣品和空白對照均沒有擴增，呈陰性；檢測發現10 μmol/μL的TaqMan探針加入量在 25 μL 體系中為1.0 μL以上均能得到較好的結果。

2.3TMV和PVY的試管捕捉實時熒光RT-PCR同時檢測結果

通過試驗發現，由于樣品中帶毒量和病毒的穩定性不一，所以同時捕捉時，對于帶毒量低、穩定性差、易降解的病毒樣品，加樣時應多加，才能得到較好的檢測結果，對于帶毒量高、穩定性好的病毒樣品，加樣時少加也能得到好的效果，本試驗中若要在同一個管中同時檢測到TMV和PVY，同一個管中加入的TMV量至少要達到3.5 mg/μL以上才能捕獲成功，PVY的加樣量至少達到6.0 mg/μL以上才能捕獲成功。當每個反應管中2對引物和2對探針同時存在時，只有對應模板被加入才發生相應的實時熒光PCR擴增反應；2個模板同時加入時，既不發生交叉反應也不影響各自反應效率（圖5）。說明針對TMV、PVY設計的引物和探針特異性強，多重試管捕捉實時熒光RT-PCR法構建成功，且檢測效果理想。

2.4DAS-ELISA法、TC-RT-PCR和試管捕捉實時熒光RT-PCR檢測方法的比較

針對本研究中選用DAS-ELISA法、TC-RT-PCR和試

管捕捉實時熒光RT-PCR法。從檢測時間上來看，試管捕捉實時熒光RT-PCR耗時最短，檢測1個病毒病樣品所用時間為100 min左右。DAS-ELISA耗時最長，檢測1個病毒病樣品所用的時間基本為5 h左右。從檢測費用上看，DAS-ELISA法遠高于TC-RT-PCR和試管捕捉實時熒光RT-PCR法。從檢測靈敏度上來看，DAS-ELISA法檢測靈敏度在 0.2 μg/mL；TC-RT-PCR法檢測靈敏度在0.32 ng/mL（圖6）；試管捕捉實時熒光RT-PCR法反應靈敏度 1.6 ng/mL（圖7）。

3結論與討論

本試驗結合TC-RT-PCR法與實時熒光RT-PCR法，構建了試管捕捉實時熒光RT-PCR法，并在此基礎上構建了雙重試管捕捉RT-PCR法，目前用于檢測廣泛發生于煙草上的主要的2種病毒病TMV和PVY，利用2種TaqMan熒光探針實時檢測2個目的基因的擴增，在同一管中RT-PCR與探針檢測同時進行，整個檢測過程只需90 min左右，且只需在加樣時打開1次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，消除了PCR產物的污染，減少了檢測步驟，節省了時間，解決了以往同時檢測TMV和PVY方法存在的不足之處，在同一個反應管中，利用多重試管捕捉和同一波段的不同熒光染料同時標記多種待測樣品，使得單管反應就能同時檢測出多種病毒病，對于大量病毒病的檢測，大大縮短了檢測時間，檢測方便快捷、經濟實惠、操作簡單、準確，靈敏度高，針對2種不同病毒病和2種病毒病復合侵染的情況，可經1個反應1次就檢測出來，省時省力，省去了RNA的提取步驟，進而省去了RNA提取時所需的試劑費，從而避免了RNA提取時的復雜操作，尤其是多種病毒同時檢測時，前期幾種RNA的提取更費時費力，此技術只須要將幾種病毒病的粗提液同時加入同一個管中，操作簡單、省時省力、特異性強，收集熒光在較高的退火溫度進行，排除了模板的非特異性擴增，無交叉反應，可用于2種病毒特異性的實時PCR檢測，且操作快速簡單、結果直觀準確。因所有試驗在封閉系統內完成，可變因素大大減少，避免了普通PCR方法容易產生交叉污染而發生非特異性的擴增，因為不需要后期處理，可防止強致癌物溴化乙錠對操作人員的危害，也不需要通過測序來對病毒進行判定，但檢測時可能由于一些病毒病樣品的帶毒量與穩定性不一致，所以捕捉時，對于穩定性差、帶毒量低的樣品，加樣時應多加，才能得到較好的檢測結果，對于穩定性好、帶毒量高的病毒加樣時少加也能得到好的效果，如TMV和PVY同時檢測時，PVY的量達到60 μL以上才能捕獲成功，而TMV卻只要加入35 μL以上就能捕獲成功，具有諸多優點的試管捕捉雙重實時熒光技術在病毒檢測方面有廣闊的應用前景。此外該方法的建立在農業生產、種子流通及種子檢驗檢疫中具有一定意義，該方法的構建成功，使TC-RT-PCR法變得更高效，豐富了病毒病的檢測方法，對病毒病的檢測具有重要的理論和現實意義。

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