基于ITS條形碼序列早期篩選枸杞種內(nèi)雜交種

石志剛++馬婷慧++萬如++李彥龍++王亞軍

摘要：利用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）條形碼序列，對枸杞雜交育種種內(nèi)雜交種進(jìn)行早期篩選研究。采用改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取枸杞葉片DNA，利用合成的特異引物對其DNA中的nrDNA ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、克隆，對目的片段進(jìn)行測序分析。結(jié)果表明：以寧夏枸杞種內(nèi)的品種寧杞1號、寧杞2號、白花枸杞作為父母本，選配雜交組合，基于ITS條形碼序列對其種內(nèi)雜交育種產(chǎn)生的雜交后代進(jìn)行聚類分析，分析雜交后代與父母本的親緣關(guān)系與差異，對其雜交后代進(jìn)行早期篩選。由結(jié)果可知，基于ITS條形碼序列可以作為早期篩選雜交育種后代的方法之一，對建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)、縮短育種周期具有重要意義。

關(guān)鍵詞：枸杞屬；ITS序列；DNA測序；篩選；雜交育種

中圖分類號： S337；S567.1+90.351文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0138-02

枸杞是我國重要的“藥食同源”功能型特色植物資源，經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、社會效益顯著[1]。寧夏是枸杞的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，截至2015年年底，寧夏枸杞種植規(guī)模達(dá)到5.71萬hm2，占全國種植總面積的42.5%；枸杞干果產(chǎn)量13萬t，占全國總產(chǎn)量的48%；年出口量6 500 t，出口額7 000萬美元，占全國出口量的65%，出口額的58%；枸杞生產(chǎn)總值突破50億元。寧夏地區(qū)自20世紀(jì)60年代就已經(jīng)開展枸杞新品種育種工作，目前寧夏農(nóng)林科學(xué)院自主選育出寧杞1號、寧杞2號、寧杞3號、寧杞5號、寧杞6號、寧杞7號、寧農(nóng)杞9號等10余個新品種，國內(nèi)科技工作者也選育出柴杞1號、蒙杞1號、精杞1號等新品種。但是枸杞育種在整體上與其他作物育種相比，還存在許多不足和缺陷，主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：（1）實(shí)用生產(chǎn)型品種相對偏少，在生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用的品種僅有寧杞1號、寧杞4號、寧杞5號和寧杞7號等4個新品種，并且其用途相對單一，不能很好地適應(yīng)枸杞產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展的方向；（2）育種手段相對單一，育種周期長、速度慢。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展很快，對于深入了解植物基因的多態(tài)性、有針對性地選擇親本、對雜種后代進(jìn)行早期鑒定等方面，都能提供更為有效的判斷依據(jù)，從而提高育種效率[2]。通過群體選優(yōu)、雜交育種、細(xì)胞融合等技術(shù)，建立多樣化育種理論體系和技術(shù)體系，培育多用途的枸杞新品種，對于提升枸杞產(chǎn)業(yè)的研究水平和枸杞產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大。本研究以枸杞雜交育種親本和雜交品系為試驗材料，通過對其種內(nèi)雜交育種產(chǎn)生的雜交后代進(jìn)行基于核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）條形碼序列的聚類分析，分析雜交后代與父母本的親緣關(guān)系與差異，以期對其雜交后代進(jìn)行早期篩選。

1材料與方法

1.1試驗材料

以寧夏枸杞種內(nèi)的品種寧杞1號、寧杞2號、白花枸杞作為父母本，以通過種內(nèi)雜交育種產(chǎn)生的雜交后代05-04-17-b、05-04-31-b、05-06-27-b、05-38-36、05-31-01、05-32-31作為試驗材料，材料名稱、來源等見表1。

1.2試驗方法

枸杞葉片DNA提取參照文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行，采用改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法。PCR擴(kuò)增引物設(shè)計、擴(kuò)增程序、反應(yīng)體系及目的片段的克隆參照筆者所在研究組前期的報道[4]。

1.3枸杞雜交育種父母本和雜交后代的親緣關(guān)系分析

采用MEGA 4.0分析軟件對ITS序列進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1ITS區(qū)序列長度和變異信息

寧夏枸杞不同品種間雜交種中，整個ITS序列長度變異范圍為559～631 bp，平均為595 bp；整個ITS1序列長度變異范圍為198～252 bp，平均為224 bp；整個5.8SnrDNA序列長度變異范圍都為154 bp；整個ITS2序列長度變異范圍為 207～225 bp，平均為217 bp。ITS區(qū)、分區(qū)長度及G+C含量變異見表2。

寧夏枸杞種內(nèi)不同雜交種植物ITS序列特征如表3所示。整個ITS區(qū)排序后的總長度為631 bp，其中ITS1、5.8S、ITS2排序后的長度分別為252、154、225 bp。將gap（空位）作missing（缺失）處理時，由于5.8SDNA序列過于保守，不適合用作系統(tǒng)發(fā)育分析，因而在本研究中利用ITS1、ITS2區(qū)序列進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)育分析。整個轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1+ITS2）對位排列后總長度為477 bp，共有173個變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)數(shù)分別為114、59個，占36.3%；保守位點(diǎn)數(shù)304個，占63.7%；有10個信息位點(diǎn)，占2.1%，69個轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，15個顛換位點(diǎn)，其中ITS1區(qū)的信息位點(diǎn)所占比例高于ITS2區(qū)，而ITS1區(qū)的轉(zhuǎn)換/顛換值高于ITS2區(qū)（表3）。

2.2親緣關(guān)系分析

對ITS區(qū)堿基序列進(jìn)行聚類分析，從圖1中可以看出親緣關(guān)系與差異。

3討論

05-06-27-b、05-4-31-b、05-4-17-b具有相同的父母本，是寧杞1號×寧杞2號，基于ITS序列分析可知，05-4-17-b父本聚在一起，而其他2個具有父母本的序列特征，從ITS序列可以初步判斷3個雜交種為真雜種。

05-31-01、05-32-31具有相同的父母本，是寧杞1號×白花，基于ITS序列分析可知，05-31-01與母本ITS序列基本一致，初步可以判定它不含父本的基因，是否為雜交后代有待進(jìn)一步確定；而05-32-31同時具有父母本的序列特征，初步判定其是真雜交后代。

05-38-36是寧杞2號×寧杞1號，基于ITS序列分析，雜種與母本具有完全一致的序列特征，初步可以判定它不含父本的基因，是否為雜交后代有待進(jìn)一步確定。

枸杞是多年生灌木，成齡期在4年以上，雜交群體的保存目前多采用活體方法，占用大量的土地資源和人力，隨著雜交育種工作的開展，雜交群體的保存和早期鑒定對于提高育種、縮短育種周期尤為重要，亟需通過雜交后代的早期鑒定來克服和緩解龐大的雜交群體規(guī)模所帶來的困難和壓力。基于ITS序列差異，從聚類圖可以初步判斷父母本與雜交后代之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，而且結(jié)合它們在植物學(xué)性狀、細(xì)胞學(xué)性狀、同工酶性狀等方面的差異，可以作為枸杞早期篩選雜交后代的依據(jù)之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]石志剛，郭文林，門惠芹. 枸杞不同種質(zhì)的nrDNA ITS序列分析研究[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2012：1-5.

[2]張漢明，許鐵蜂，秦路平，等. 中藥鑒別研究的發(fā)展和現(xiàn)代鑒別技術(shù)介紹[J]. 中成藥，2000，22（1）：101-110.

[3]Cheng K T，Chang H C，Huang H，et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J]. Bot Bull Acad Sin，2000，41（1）：11-14.

[4]Shi Z G，An W，F(xiàn)an Y F，et al. Preliminary studies on identification of Lycium Linn. germplasm resources by nrDNA ITS sequencing[J]. Agricultural Science and Technology，2008，36（16）：6687-6689.吳玉香，王漢琪，沈少炎，等. 不同施肥方案對太子參活性成分的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（6）：140-143.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.036