乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒品質的影響

李建軍+周劍忠++董月++夏秀東++王英

摘要：通過測定經植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-L1-3和明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）T-L1胞外多糖處理前后黑莓果酒中蛋白質、總酚、花色苷、色度、澄清度以及熱穩定性等參數的變化，研究乳酸菌胞外多糖處理對黑莓果酒品質的影響。結果表明，適量的乳酸菌胞外多糖處理黑莓果酒，能明顯降低導致果酒沉淀的蛋白質、總酚含量，顯著提高果酒的澄清度和熱穩定性，顯著延長果酒的儲存穩定性，另外，胞外多糖處理降低了果酒的花色苷含量和果酒的色澤；相同含量的FM-L1-3和T-L1 胞外多糖處理果酒，對果酒品質影響不同。與對照相比，乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒品質均具有提升作用。

關鍵詞：乳酸菌；胞外多糖；黑莓果酒；品質

中圖分類號： TS262.7文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0178-04

黑莓果酒中富含多酚、黃酮、類黃酮、葉黃素、花青素、葉酸、微量元素錳等物質，不僅可以提高人體免疫力，還能降血壓[1]。相對于葡萄酒，黑莓果酒不僅富含多酚類物質，而且黑莓果酒有著更有效的體外抗氧化的功效[2]。黑莓果酒中的花青素可預防心血管病，降低中風風險，花青素和原花青素可有效改善血管健康狀況，減少動脈粥樣硬化，預防和降低冠心病和中風的風險。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，兼具豐富營養和功能的黑莓果酒產業將會有很大的發展前景。

黑莓果酒在貯藏過程中存在一些品質上的波動，例如出現渾濁、沉淀和色澤減弱。雖說果酒的輕微渾濁和少量沉淀對消費者的健康并沒有多大的影響，但是這將大大影響消費者購買意向。銷售量是每個產品生命力的體現，為了提高黑莓果酒的市場前景，必須大大提高黑莓果酒的儲存穩定性。

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌生長代謝過程中分泌到細胞壁外的黏液多糖和莢膜多糖的總稱[3-4]，具有改善發酵食品質構、口感、流變性、穩定性、持水性等獨特的理化特性，同時還具有多種生物活性，具有抑菌、抗誘變、抗腫瘤、降膽固醇、調節腸胃功能等作用[5-8]。近年來對乳酸菌EPS的研究和開發引起廣大研究者和食品加工業的重視[9-11]。

目前，乳酸菌胞外多糖對果酒品質的影響，尤其是果酒儲存穩定性的影響還未見報道。本課題將探究2種乳酸菌多糖的添加對黑莓果酒中蛋白質含量、總酚含量、花色苷含量、澄清度、色度、熱穩定性及儲存穩定性的影響，分析乳酸菌胞外多糖對果酒品質的影響，以期開發新的具有提高黑莓果酒品質功效的物質來源。

1材料與方法

1.1試驗材料

黑莓采自江蘇省南京市溧水區黑莓種植基地。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-L1-3和明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）T-L1，由江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室保存。

1.2試劑及儀器

試劑：福林酚（Folin-Phenol），SIGMA；沒食子酸，上海西隴化工有限公司；福爾馬肼濁度標準溶液，上海昕瑞儀器儀表有限公司；無水碳酸鈉，南京壽德試劑有限公司；

設備：紫外可見分光光度計UV-1600PC，上海美普達儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；雙向磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市中大儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1果酒制備工藝黑莓果清洗→打漿→配料（添加偏重亞硫酸鉀、果膠酶和蔗糖）→接種→發酵→過濾→澄清。

1.3.2乳酸菌培養及其胞外多糖的提取挑取活化后單菌落分別接種到液體MRS試管中，37 ℃條件下培養24 h，傳代2次。按3%的接種量分別接種裝有液體MRS的三角瓶中，培養24 h。胞外多糖的提取方法參照文獻[12]并做適當改進。在4 ℃條件下離心去除菌體。上清液用蛋白酶脫除蛋白，再添加3倍體積的冷乙醇于上清液中，4 ℃ 下靜置過夜。冷凍離心得沉淀物，用冷乙醇洗滌沉淀物3～5次，利用透析袋（截留分子量為5 000～8 000）進行透析處理，冷凍干燥得胞外多糖提取物。

1.3.3黑莓果酒的胞外多糖處理取黑莓果酒200 mL置于250 mL的試劑瓶中，按照胞外多糖終濃度分別為50、250、500 mg/L 將FM-L1-3和T-L1的胞外多糖分別加入到黑莓果酒中，充分混勻后，靜置5～7 d，經4 500 r/min離心15 min，獲得胞外多糖處理的黑莓果酒，同時以未加多糖的黑莓果酒作為對照。試驗重復3次。

1.3.4果酒各理化指標測定

1.3.4.1果酒中蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍染色法，具體操作方法參照文獻[13]。

1.3.4.2果酒中總酚含量測定采用Folin-酚試劑法，具體操作方法參照文獻[14]。

1.3.4.3果酒中總糖的測定采用苯酚硫酸法，具體操作方法參照文獻[15]。

1.3.4.4花色苷的測定在2個 10 mL 的容量瓶里各加入 1 mL 稀釋后的黑莓果酒，分別用 pH值1.0的緩沖溶液（0.2 mol/L KCl，用HCl調pH值為1.0）及 pH值4.5（1 mol/L CH3COONa，用HCl調pH值為4.5）的緩沖溶液定容。將定容后的溶液放置在冰箱， 4 ℃避光靜置2 h 后，在波長510 nm及700 nm下測吸光度D，結果以矢車菊-3-O-葡萄糖苷計 [16]?；ㄉ蘸坑嬎愎剑?/p>

花色苷含量（mg/L）=（D×m×n×1 000）/（ε×L）。

式中：D=（D510 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0） -（D510 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）；m為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2；n為稀釋倍數，10；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26 900；L為比色皿的光程長度，1。

1.3.4.5色度的測量[17]將處理好的果酒倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，于420、520、620 nm 處測其吸光度，以三者吸光度之和表示色度。

1.3.4.6澄清度的測量將果酒倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，于680 nm處測其透光率，具體操作方法參照文獻[18]。

1.3.4.7熱穩定性測定[19]將處理好的果酒取5 mL置于試管中，置于80 ℃水浴中處理6 h后，取出放置在4 ℃下 16 h，然后在室溫下用濁度計測定其濁度值，以樣品熱處理后與熱處理前的濁度差值（ΔNTU）表示其熱穩定性。

1.3.4.8果酒的儲存穩定性根據前期的試驗結果，選擇終濃度為250 mg/L的FM-L1-3和T-L1的胞外多糖處理黑莓果酒，每隔3個月測定果酒的濁度值，分析時間為12個月，以未用胞外多糖處理的果酒為對照。

2結果與分析

2.1乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中蛋白質含量的影響

一般來說，果酒中蛋白質含量很低，不是果酒的主要營養成分，每升果酒中蛋白質含量為幾十到幾百毫克之間。但是，已有的研究結果表明，果酒中蛋白質是引起果酒渾濁的一個必要因素，且蛋白質的含量越高，果酒越不穩定，越易發生渾濁沉淀現象[20-22]，導致果酒的貨架期大大縮短。如何去除果酒中的蛋白質，保持果酒的澄清穩定性，延長果酒的貨架期，是目前果酒產業研究的一個熱點。

前人的研究結果顯示，向果酒中加入一些澄清劑，可以降低果酒中的蛋白質含量，提高果酒的澄清穩定性。Francois等利用皂土處理葡萄果酒，隨著皂土添加量的增加，果酒中蛋白質的含量呈現降低趨勢，當皂土添加量達到0.5 g/L時，蛋白質含量可以去除50%[23]。王英等利用皂土處理黑莓果酒，當皂土用量為0.6 g/L時，蛋白質的去除率達到62.4%[24]。另外，添加單寧也會不同程度地降低果酒中的蛋白質含量。本研究中乳酸菌胞外多糖的添加對果酒中蛋白質含量的影響見圖1。從圖1可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的蛋白質含量整體呈現減少趨勢。與對照相比，當胞外多糖添加量為500 mg/L時，FM-L1-3胞外多糖處理的果酒中蛋白質含量降低了35.82%，T-L1胞外多糖處理的果酒中蛋白質含量降低了46.06%。可見，乳酸菌胞外多糖具有優良的去除果酒中蛋白質的功能，且不同乳酸菌的胞外多糖去除果酒中蛋白質能力不同。

2.2乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中總酚含量的影響

酚類物質是果酒中一個重要組成部分，也是一個重要的功能成分，對果酒的感觀特性（顏色、風味、苦味等）有重要貢獻，由于其具有抗氧化、抑菌、抗炎癥等功能活性而備受關注[25-26]。同時已有的研究表明，酚類物質也是引起果酒沉淀的一個重要的非生物因素[27-28]。添加不同的澄清劑，對果酒中的酚類物質也具有不同程度的降低作用，進而達到提高澄清穩定性的作用。通常用聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）去除果酒中的酚類物質，通過氫鍵與酒中的酚類物質絡合，對小分子物質具有很強的吸附能力。乳酸菌胞外多糖的添加對果酒中總酚含量的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的總酚含量整體呈現減少趨勢。與對照相比，當胞外多糖添加量為500 mg/L時，FM-L1-3胞外多糖處理的果酒中總酚含量降低了24.34%，T-L1胞外多糖處理的果酒中總酚含量降低了32.71%?？梢姡樗峋舛嗵蔷哂休^好的去除果酒中總酚的功能，且不同乳酸菌的胞外多糖去除果酒中總酚能力不同。

2.3乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中總糖含量的影響

從圖3可以看出，在FM-L1-3的胞外多糖含量添加量為0～250 mg/L時，果酒體系中的總糖含量變化不大，當多糖含量添加為500 mg/L時，果酒體系中總糖含量反而增加了2.91%。T-L1的胞外多糖含量添加量為0～250 mg/L時，果酒體系中的總糖含量呈現下降趨勢，當多糖含量添加為500 mg/L時，果酒體系中總糖含量與對照相比保持一致?？傮w來說，乳酸菌胞外多糖對果酒中的總糖含量影響不大。

2.4乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中花色苷含量的影響

果酒顏色是果酒的一個重要感官品質，也是判斷果酒酒齡的一個重要依據，花色苷是賦予果酒顏色的一類主要化合物。另外，花色苷是一種功能性水溶色素，具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性[5]。乳酸菌胞外多糖的添加對果酒中花色苷含量的影響見圖4。從圖4可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的花色苷含量整體呈現減少趨勢。與對照相比，當胞外多糖添加量為500 mg/L時，FM-L1-3胞外多糖處理的果酒中花色苷含量降低了12.57%，T-L1胞外多糖處理的果酒中花色苷含量降低了15.43%。結果顯示，乳酸菌胞外多糖能夠不同程度地降低果酒中的花色苷含量，且不同乳酸菌的胞外多糖對果酒中花色苷的影響能力不同。

2.5乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒色澤的影響

從圖5可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的色澤整體呈現減少趨勢。這是由于胞外多糖的加入，降低了果酒中呈色物質（酚類物質和花色苷）含量，進而導致了果酒色澤的降低。從圖5中還可以看出，乳酸菌FM-L1-3 和

T-L1的胞外多糖添加相同含量，但對果酒的色澤影響不同，相同含量胞外多糖處理果酒，乳酸菌 T-L1的胞外多糖對果酒的色澤影響更大，這與乳酸菌 T-L1胞外多糖處理對果酒中的酚類物質和花色苷物質的影響趨勢相同，T-L1胞外多糖對多酚和花色苷含量的影響更大。

2.6乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒的澄清度的影響

果酒澄清度是果酒的一個重要感官品質，雖然很多果酒商品都會標注有少許沉淀不影響飲用。但是，帶有沉淀或少許渾濁的果酒會影響消費者的購買欲。乳酸菌胞外多糖的添加對果酒澄清度的影響見圖6。從圖6可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒澄清度整體呈現增加趨勢。與對照相比，當胞外多糖添加量為500 mg/L時，FM-L1-3胞外多糖處理使黑莓果酒的澄清度增加了15.53%，T-L1胞外多糖處理使黑莓果酒的澄清度提高了22.12%。這與T-L1和FM-L1-3胞外多糖處理時對影響果酒澄清穩定性的蛋白質和酚類物質的結果一致，前面的研究結果顯示，相同含量的胞外多糖處理，T-L1胞外多糖處理對果酒中蛋白質和總酚含量的去除能力更強。

2.7乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒熱穩定性的影響

從圖7可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒的熱穩定性呈現先增加后降低的趨勢。與對照相比，胞外多糖的添加能夠降低ΔNTU值，增加黑莓果酒的穩定性，但是，不同胞外多糖的添加量和不同乳酸菌的胞外多糖對果酒的熱穩定性的影響不同。從圖7可以看出，T-L1胞外多糖添加量為50～250 mg/L時，ΔNTU的值最小，黑莓果酒的熱穩定性最高，當繼續增加胞外多糖，ΔNTU的值開始增大，熱穩定性開始降低，試驗結果顯示，并不是果酒中總酚物質、蛋白質含量、花色苷含量越低，果酒穩定性越高，這可能是由于影響果酒澄清穩定性的因素除了蛋白質、總酚和花色苷物質之外，還有其他的因素起到重要作用，這將在后續的研究工作中做進一步的探討和分析。

2.8乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒儲存穩定性的影響

果酒貨架期澄清度的穩定性是影響果酒品質的重要指標之一。乳酸菌胞外多糖的添加對黑莓果酒儲存期澄清度的影響見圖8。從圖8可以看出，隨著儲存時間的延長，不同處理的果酒的NTU值增大，可見，隨著儲存時間的延長，果酒的澄清度呈現下降趨勢。從圖8還可以看出，與對照相比，在相同的儲存時間內， 胞外多糖添加能顯著提高果酒澄清度的穩定

性；另外，T-L1胞外多糖處理效果要高于同等濃度的FM-L1-3胞外多糖的處理效果。

3結論

本研究測定了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-L1-3 和明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）T-L1胞外多糖處理前后黑莓果酒中蛋白質、總酚、花色苷、色度、澄清度以及熱穩定性等參數的變化，結果表明，適量的乳酸菌胞外

多糖處理黑莓果酒，能明顯降低導致果酒沉淀的蛋白質、總酚含量，顯著提高果酒的澄清度和熱穩定性，顯著延長果酒的儲存穩定性，另外，胞外多糖處理降低了果酒的花色苷含量和果酒的色澤。

相同含量的FM-L1-3和T-L1 胞外多糖處理黑莓果酒，對果酒品質影響不同，說明不同的乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒品質影響不同。

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