茶皂素提取純化及其與山梨酸鉀復配的抑菌防腐效果

陳小紅+吳德武++陳松茂++黃東波

摘要：以茶籽粕為原料，采用微波-超聲波協同輔助提取茶皂素，在單因素試驗基礎上，以茶皂素得率為響應值通過響應面法優化茶皂素的提取工藝；以反相柱層析法純化提取的茶皂素，對純化的茶皂素通過紅外、紫外光譜進行表征；以純化后的茶皂素與山梨酸鉀復配，通過測定試樣的菌落總數、揮發性鹽基氮（TVB-N）含量，考察復配方對龍巖風味泡鴨爪的抑菌防腐效果。結果表明，在微波功率700 W，作用時間2 min的條件下，茶皂素的最優提取工藝為：乙醇濃度72%，液料比11 mL ∶1 g，超聲波功率79 W，浸提時間76 min。在優化條件下，茶皂素得率為（13.5±0.2）%，純度為68.2%，反相柱層析法純化提取的茶皂素，可得到純度為99.2%的茶皂素，茶皂素與山梨酸鉀復配使用對龍巖風味泡鴨爪的防腐抑菌起協同作用，可延長泡鴨爪的保質期。

關鍵詞：茶籽粕；微波-超聲波；茶皂素；山梨酸鉀；泡鴨爪；防腐劑

中圖分類號： TS205文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0186-05

茶籽粕是食用油茶籽榨油后得到的殘渣，富含10%～15%的茶皂素[1]，是提取茶皂素的天然原材料之一。從茶籽粕中提取得到的茶皂素又叫做茶皂苷，是一類復雜的糖苷化合物，具有一定的抗細菌效果[2]，對革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，對單細胞真菌酵母菌表現出較強的抑菌活性[3-4]。

由于超聲波在介質傳播中產生特殊的“空化效應”，微波在輻射過程高頻電磁波可穿透介質直接作用于植物內部細胞的效果，近年來，微波提取與超聲波提取技術被廣泛應用在茶皂素的提取工藝研究中[5-9]。此外，在食品生產加工中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、酵母菌等是常見的腐敗菌種，而山梨酸鉀對革蘭氏陽性短芽孢桿菌菌株能有效抑制，對腸桿菌的抑制作用居中，對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑制作用較小[10]。因此，本試驗在固定微波功率700 W，作用時間2 min的條件下，通過響應面法優化微波-超聲波協同輔助提取茶皂素的提取工藝條件；通過茶皂素與山梨酸鉀復配，考察其復配方對龍巖風味泡鴨爪的防腐抑菌效果。

1材料與方法

1.1試驗儀器

KQ-100DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MG08S一203型微波儀（南京匯研微波系統工程有限公司）；YP-B5001電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；UV-5600紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Nicolet Avatar330傅立葉紅外光譜儀（美國Termo Electron公司）；HS-840u型水平層流單人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DRP-9272型電熱恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）等。

1.2試驗材料

油茶籽粕（龍巖市茶麗健茶油開發有限公司）；茶皂素標準品（上海阿拉丁試劑有限公司）；50 μm ODS-A反相硅膠填料（日本YMC公司）；鴨爪（龍巖市常愛食品有限公司）；無水乙醇等化學試劑均為國產分析純。

1.3試驗方法

1.3.1茶籽粕中茶皂素的提取茶籽粕粉碎過80目篩，稱取30 g于索氏提取器在石油醚中回流脫脂24 h，取出烘干。重復此操作，制備脫脂茶籽粕若干備用。然后稱取5.0 g的脫脂茶籽粕粉末放入100 mL燒杯中加一定體積濃度的乙醇溶液，攪拌分散均勻，放入微波儀中，在700 W功率下微波輻射2 min，之后取出，在超聲儀中在不同超聲波功率、超聲提取時間的條件下，進行浸提。浸提完畢，減壓抽濾得到茶皂素浸提液，測定濾液體積V，裝入錐形瓶中。

1.3.2浸提液中茶皂素含量的測定[10]采用80%的乙醇溶液為溶劑，稱取茶皂素標準品，準確配制180、360、540、720、900 μg/mL的標準溶液。用移液槍取1.00 mL茶皂素標準溶液加入試管中，往其中加入1 mL 8%香草醛乙醇溶液和 10 mL 77%硫酸溶液，充分混合搖勻后，置于60 ℃恒溫水浴中反應15 min，取出后置于冰水浴中冷卻10 min，然后放至室溫后，把液體移入玻璃比色皿，以80%的乙醇溶液為參比，在波長為550 nm處測定溶液的吸光度，以茶皂素質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線。擬合得回歸方程為 y=1 247.399 4x-30.560 5，r2=0.998 7。

準確移取茶皂素濾液1.00 mL至250 mL容量瓶中，以80%的乙醇溶液為溶劑，定容搖勻待測，取1.00 mL定容后的稀釋茶皂素液加入試管中，采用上述方法測定溶液的吸光度，根據茶皂素濃度-吸光值標準曲線擬合得到的方程，求得稀釋定容后茶皂素溶液的茶皂素含量，進而求出茶籽粕中茶皂素提取得率。

1.3.3茶皂素的反相柱層析純化[11-12]以50 μm ODS-A反相硅膠為填料，采用無水乙醇勻漿濕法上柱。稱取3 g提取、干燥后的茶皂素溶解于40 mL 5%的甲醇溶液中，通過分液漏斗控制以1 mL/min的速度上樣，以1.5 mL/min的洗脫速度梯度洗脫，先采用50%的甲醇溶液以2倍柱床體積淋洗；再用60%的甲醇溶液以2倍柱床體積淋洗，每2 min收集1份洗脫液，對每份洗脫液進行紫外吸光檢測。對215 nm處有強吸收峰的洗脫液進行濃縮、干燥。

1.3.4茶皂素純化物表征[11-12]

1.3.4.1紫外掃描以60%甲醇溶液為溶劑，將純化后的茶皂素配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，進行紫外掃描，得到紫外掃描光譜圖。

1.3.4.2傅立葉紅外掃描取微量純化后茶皂素樣品與KBr混合后壓片，進行紅外掃描，得到紅外掃描光譜圖。

1.3.5茶皂素與山梨酸鉀復配防腐劑對龍巖泡鴨爪的抑菌防腐試驗按我國《食品添加劑使用衛生標準》（GB 2760—2014）山梨酸在熟肉制品中添加的最大限量為0.075 0 g/kg，本試驗配制0.020 0 g/kg的山梨酸鉀溶液，取0.020 0 g/kg的山梨酸鉀溶液為溶劑分別配制濃度為100、80、60、40、20、0 mg/mL 的茶皂素、山梨酸鉀復配溶液200 mL分裝至4個錐形瓶中標以A、B、C、D、E、F，滴加冰醋酸調節pH值至3.80，加入龍巖市常愛食品有限公司提供的初步加工的鴨爪進行密封浸泡，以F組為對照組，每隔2 d分別取1次樣液檢測其細菌總數和揮發性鹽基氮含量，測定5次。菌落總數的檢測方法按照GBT4789.2—2010，采用平板傾注法對試樣的菌落總數進行測定，采用lgCFU/g表示檢測的結果；試樣揮發性鹽基氮（TVB-N）的檢測方法采用半微量定氮法，結果以 mg/100 mL 表示[13]。

2結果與分析

2.1微波-超聲波輔助單因素浸提茶皂素試驗

2.1.1乙醇濃度對茶皂素浸提得率的影響按“1.3.1”節的方法，在液料比為8 mL ∶1 g，超聲波功率為70 W，浸提時間為50 min的條件下考察乙醇濃度對茶皂素浸提得率的影響，結果如圖1所示。茶皂素浸出濃度隨乙醇濃度增大而增大，在乙醇濃度為70%時，茶皂素浸出濃度達到最大值。但隨乙醇濃度進一步增大，茶皂素浸出濃度略有降低。因此取乙醇的體積濃度70%為適宜的浸提液濃度。

2.1.2液料比對茶皂素浸提得率的影響在乙醇體積分數為70%，超聲波功率為70 W，浸提時間為50 min的條件下，按“1.3.1”節的方法，考察不同液料比對茶皂素浸提得率的影響，結果如圖2所示。隨料液比增大，茶皂素浸提得率隨之增大，料液比超過10 mL ∶1 g后，茶皂素浸提得率隨料液比的增大而略有增加。為了避免溶劑的浪費且降低茶皂素干燥的能源，因此取料液比10 mL ∶1 g較為適宜。

2.1.3超聲波功率對茶皂素浸提得率的影響在乙醇體積濃度為70%，料液比為10 mL ∶1 g，浸提時間為50 min的條件下，按“1.3.1”節的方法，考察不同超聲波功率對茶皂素浸提得率的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，隨超聲波功率增大，茶皂素浸提率隨之增大，但超聲波功率達到80 W后，超聲波功率進一步增大，茶皂素浸提得率稍許降低，可能是浸提液在超聲功率80 W時，超聲波的空化趨于飽和，此時進一步增大超聲波強度反而降低了空化強度，對茶皂素浸提得率的提高反而不利。因此，取80 W為適宜的超聲波功率。

2.1.4浸提時間對茶皂素浸提得率的影響在乙醇體積濃度為70%，料液比為10 mL ∶1 g，超聲波功率為80 W條件下，按“1.3.1”節的方法，考察不同浸提時間對茶皂素浸提得率的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，茶皂素浸提得率隨浸提時間的延長而提高，浸提80 min，茶皂素浸提得率達到最大值，進一步延長浸提時間，茶皂素浸提得率反而略有降低。主要是因為在浸提 80 min 時，茶皂素溶出達到平衡，繼續延長浸提時間，茶籽粕粉中的多糖、蛋白質等水溶性雜質與茶皂素溶出產生競爭，抑制茶籽粕粉中茶皂素的溶出[7]，所以引起茶皂素浸提得率略有降低。因此，取80 min為適宜的浸提時間。

2.2響應面法優化微波-超聲波輔助浸提茶皂素工藝條件

以茶皂素浸提得率為響應值，茶籽粕粉提取茶皂素的乙醇濃度、液料比、超聲波功率和浸提時間為自變量。在單因素試驗的基礎之上，通過Box-Behnken優化茶籽粕粉提取茶皂

素的工藝條件，設計的因素與水平見表1；按Box-Behnken優化的浸提條件進行茶皂素的提取試驗，測得不同提取條件下茶皂素的浸提得率，結果見表2；對茶皂素提取的試驗結果進行回歸分析，結果見表3；回歸方程的殘差正態概率分布圖見圖5。

由表3模型的F值=4.27，表明模型是顯著的，由P值分析可知A、B、C、D 4個因素對模型的影響顯著；A、C，C、D雙因素對模型的交互影響顯著；A、C、D 3個因素的平方項對模型的結果影響顯著。對

由失擬項P值的數值為0.594 1，為不顯著，方程的R2=0.987 3，圖5中回歸方程的殘差正態圖呈一條直線，說明回歸分析得到的方程擬合程度好，可信度高，可以通過擬合的方程預測茶皂素浸提得率。考慮到A、C，C、D雙因素對模型的交互影響顯著，因此本研究考察A、C，C、D雙因素交互影響的響應面曲線及對應的等高線圖，其結果如圖6、圖7所示。

由圖6因素A、C響應面分析立體圖及相應等高線圖可知乙醇濃度在72%～75%、超聲波功率在78～82 W的區間范圍內可達到響應面頂點，等高線圖中出現圓心區間，表明在這個范圍內響應值有出現最優點；由圖7因素C、D響應面分析立體圖及相應等高線圖可知，響應面頂點值出現在因素C、D較大的交互區間，在等高線圖上出現較大的橢圓心區，表明因素C、D對響應值茶皂素浸提得率的交互影響更顯著。

通過響應面法對表2試驗結果進行最優化，獲得微波-超聲波輔助從茶籽粕粉浸提茶皂素的最優工藝：700 W功率微波輻射2 min條件下，乙醇濃度為72.35%、液料比為 11 mL ∶1 g、超聲波功率為78.68 W、浸提時間為 75.83 min。

在最優條件下，響應面法預測獲得的茶皂素浸提得率為13.82%。

2.3響應面法優化微波-超聲波輔助浸提茶皂素工藝條件的驗證

對響應面法優化微波-超聲波輔助浸提茶皂素工藝條件的可靠性進行驗證，700 W功率微波輻射2 min條件下，取乙醇濃度為72%、液料比為11 mL ∶1 g、超聲波功率為 79 W、浸提時間為76 min，從茶籽粕粉微波-超聲波輔助浸提茶皂素，平行試驗5次，結果取平均值，測得茶皂素浸提得率為 （13.5±0.2）%，干燥后測得其純度為68.2%。與預測值的相對誤差為2.2%，表明響應面法建立茶皂素浸提得率的模型可信度高，能夠指導從茶籽粕粉中采用微波-超聲波輔助浸提茶皂素。

2.4反相柱層析純化后茶皂素的表征

對提取、干燥獲得的茶皂素進行反相柱層析純化，純化后樣品的紅外吸收光譜如圖8、紫外吸收光如圖9所示。

由圖8可見，在2 920、2 850 cm-1處出現茶皂素烷烴配基的C—H伸縮振動吸收峰。在1 610 cm-1處出現CC伸縮振動吸收峰，在1 385 cm-1處出現—OH伸縮振動吸收峰，在1 075、1 045 cm-1與處出現C—O伸縮振動強吸收峰，與文獻報道的茶皂素紅外光譜值[14]基本一致。由圖9可見反相柱層析純化后的樣品在紫外吸收光區僅于波長215 nm處有最大吸收峰，與文獻[15]相符，在波長230 nm后沒有出現明顯的吸收峰，表明茶皂素提取物中的單寧、黃酮等雜質得到了有效的分離，測得純化后的樣品純度達99.2%。

2.5茶皂素與山梨酸鉀復配防腐劑對龍巖泡鴨爪的抑菌防腐作用

茶皂素與山梨酸鉀復配防腐劑對龍巖泡鴨爪的抑菌防腐作用可通過泡鴨爪樣液稀釋培養的細菌總數（lgCFU/g）及樣液揮發性鹽基氮（TVB-N）這2個指標進行評價，A、B、C、D、E以及對照組F共6個樣的細菌總數（lgCFU/g）及揮發性鹽基氮（TVB-N）隨試樣保存時間（d）的變化如圖10、圖11所示。

由圖10可見，0.020 0 g/kg山梨酸鉀樣液浸泡的泡鴨爪在保存到10 d后菌落已經蔓延，茶皂素與山梨酸鉀復配比對泡鴨爪試樣的抑菌效果比單獨使用山梨酸鉀作防腐劑的抑菌效果要好，隨復配方中茶皂素含量增大，抑菌效果增強；由圖11可見，泡鴨爪在相同保存天數，茶皂素與山梨酸鉀復配可大幅降低泡鴨爪揮發性鹽基氮的含量，復配方中茶皂素含量達到60 mg/mL時，復配方中進一步增加茶皂素含量對泡鴨爪中揮發性鹽基氮含量的降低基本沒有影響。結果表明茶皂素與山梨酸鉀復配使用對龍巖風味泡鴨爪的防腐抑菌起協同作用，可延長泡鴨爪的保質期。

3結論

通過響應面法優化微波-超聲波協同輔助提取茶皂素，

得到浸提最優工藝：微波功率700 W，輻射2 min條件下，乙醇濃度為72%、液料比為11 mL ∶1 g、超聲波功率為79 W、浸提時間為76 min。在最優條件下茶皂素浸提得率為 （13.5±0.2）%，干燥后測得其純度為68.2%；通過反相柱層析純化提取的茶皂素，可得到純度為99.2%的茶皂素；茶皂素與山梨酸鉀復配使用對龍巖風味泡鴨爪的防腐抑菌起協同作用，可延長泡鴨爪的保質期。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.050