新疆白蕓豆中凝集素的提取及純化工藝

高澤磊+田童童++張建

摘要：為了研究新疆白蕓豆中凝集素的提取及純化工藝，以凝集素特異性活力為評價指標，通過單因素及響應面分析法對新疆白蕓豆中的凝集素進行研究。結果表明，新疆白蕓豆中凝集素提取的最佳工藝參數為料液比 1 g ∶10 mL、pH值7.5、提取時間20 h、提取液為磷酸鹽緩沖溶液（PB），在該條件下模型預測凝集素特異性活力為 1 209.04 HU/mg，實際試驗值為1 193.62 HU/mg。利用二乙氨乙基（DEAE）A-50陰離子交換層析和Sephadex G-75 凝膠層析進行純化，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，確定目標凝集素的分子量為30～40 ku。

關鍵詞：白蕓豆；凝集素；響應面分析；純化

中圖分類號： TS201.1；R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0191-05

凝集素（lectin）是一類至少有1個非催化結構域、能非共價地可逆結合專一性單糖或寡糖的非免疫源性、非酶本質的糖結合蛋白，目前在動物、植物、微生物和病毒中均有發現[1-3]。關于凝集素的免疫作用、抗營養作用（致毒作用）、使細胞表面成分再分布、修飾細胞膜酶的活力、阻斷卵受精、對脂肪細胞具有類似胰島素的活性等也逐漸被研究和證實[4-5]。目前對于凝集素的研究主要集中于植物凝集素，由于凝集素對于單糖或糖復合物特異性結合的能力，使其在如信號轉導、免疫反應、植物防御等諸多信號過程中均具有重要作用。同時，凝集素具有細胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導細胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學、醫學及農業方面均有較好的研究價值和應用前景。

在植物凝集素研究中發現，豆科植物凝集素種類最豐富，有600多種，其中70多種已經被分離純化，大多來自豆科植物的種子，在成熟種子中占蛋白質總含量的10%左右[6]。另外，在其他組織，如葉、莖、果實、樹皮、根中也分布著一些與種子凝集素高度同源的凝集素[7-9]，它們雖然與種子凝集素有類似的氨基酸序列和糖結合特異性，但仍然是由不同基因編碼的。豆科植物凝集素一級氨基酸序列和三級結構相似性很高，但是糖專一性和四級結構卻有很大的不同[10]。因此，研究不同豆科類來源凝集素的結構，對于豆科類凝集素在生物學、農學和醫學領域的應用具有重要的意義。

白蕓豆（white kidney bean）屬豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papiliononideae）菜豆族菜豆屬[11]。由于其營養價值豐富（100 g干豆中含碳水化合物37.6%～48.5%，蛋白質 19.9%～20.0%，脂肪1.6%～2.1%，鈣120 mg，鐵10 mg），因此可作為一種高鉀低鈉食品，適合高血脂、心臟病、動脈硬化和忌鹽者食用[12]，而且食用后不會產生腹瀉、乏力、厭食、體質量反彈等現象，完全符合世界衛生組織的減肥原則[13-16]。因此，自白蕓豆從阿根廷、墨西哥引進并經人工栽培馴化后已經在全國各地廣泛種植。然而，目前關于白蕓豆中凝集素的研究卻鮮有報道。因些，本研究以新疆白蕓豆為研究對象，通過響應面分析法優化凝集素的提取工藝，并通過實際試驗考察以驗證響應面模型的正確性。利用二乙氨乙基（DEAE）A-50陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析對凝集素的粗提取物進行純化，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，確定目標凝集素的分子量，以期為后續研究其結構及生理功能打下基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

主要材料：白蕓豆，購自新疆石河子市好家鄉超市。主要試劑：牛血清蛋白（分析純），天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純），天津市福晨化學試劑廠；氯化鈉（分析純）、分析純乙醇（95%），天津市永晟精細化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純），北京拜爾迪生物科技有限公司；考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）G-250（分析純），Biotopped。

1.2儀器與設備

主要儀器與設備：PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；BINDER電熱恒溫鼓風干燥箱，北京航鵬普瑞技術開發中心；Heraeus Multifuge X3電動離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RHP-600高速粉碎機，浙江榮浩工貿有限公司；KQ-200VDE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計，島津（中國）有限公司；JM-B10002電子天平，諸暨市超澤衡器設備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1原料預處理將市場上購買的白蕓豆去除雜質，準確稱取30 g，在4 ℃冰箱中用150 mL蒸餾水浸泡24 h，撈去雜質并瀝干后，手工去皮，在35 ℃烘箱中干燥后經粉碎機粉碎，過80目篩得到白蕓豆種子粉末。將經過上述處理的樣品裝入聚乙烯袋中，4 ℃冰箱中保藏備用。

1.3.2蛋白質濃度的測定對蛋白質含量的測定采取的是考馬斯亮藍G-250法。參考王孝平等的方法[17]，略有改動。

1.3.3白蕓豆凝集素活力檢測參照李笑梅等的方法[18-19]，略有改動。利用采血管抽取新鮮雞血10 mL，抽取 2 mL 至肝素鈉抗凝管中。將新鮮血液倒入離心管中并于 3 000 r/min 離心3 min，用移液槍去除上層血清，向沉淀中添加生理鹽水以清洗血紅細胞。輕輕顛倒搖勻洗滌，然后再次于3 000 r/min離心3 min，去除上清液，如此重復操作洗滌3次。根據紅細胞壓積，按照離心出的紅細胞體積，加入生理鹽水配成濃度2%的紅細胞懸液，在4 ℃冰箱中保存備用。在96孔反應板上，每孔加入50 μL生理鹽水；在96孔板各排第1孔內分別加入50 μL樣品溶液，混勻后從第1孔吸取50 μL加入第2孔，混勻后再吸取50 μL加入第3孔，按此方法倍比稀釋到第11孔，混勻后吸取50 μL棄去，以第12孔作空白對照；再在每孔內加入50 μL紅細胞懸液，水平搖動，放置1.5 h后觀察凝集效果。凝集素的特異性活力計算方法見式（1）：

特異性活力（HU/mg）=血凝滴度（2n）×1 000 μg/mg1每孔添加體積（μL）×凝集素或粗蛋白濃度（μg/μL）。（1）

式中：n為樣品經過倍比稀釋后在96孔“V”形板上的凝集孔數，孔；2n為凝集素的血凝滴度，指在96孔板上使雞血紅細胞凝集的最小稀釋倍數。

1.3.4提取條件優化單因素試驗

1.3.4.1提取劑的確定準確稱取10 g豆粉，按料液比 1 g ∶10 mL，分別加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PB，pH值為7.6）、生理鹽水、去離子水、Tris-HCl（pH值為7.6），超聲波振蕩20 min后，在4 ℃冰箱中進行浸提，設定提取時間為18 h；浸提液經4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于6 000 r/min離心20 min，將得到的上清液分別用96孔“V”形板反應法和考馬斯亮藍G-250法進行血凝檢測和蛋白質含量測定，確定最佳提取液。

1.3.4.2提取液pH值的確定準確稱取10 g豆粉，按料液比1 g ∶10 mL，分別加入0.05 mol/L pH值為6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的PB，超聲波振蕩20 min后，在4 ℃冰箱中進行浸提，設定提取時間為18 h；浸提液經4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于7 000 r/min離心20 min，將得到的上清液分別利用96孔“V”形板反應法和考馬斯亮藍G-250法進行血凝檢測和蛋白質含量測定，確定最佳pH值。

1.3.4.3料液比的確定準確稱取10 g豆粉，分別按 1 g ∶6 mL、1 g ∶8 mL、1 g ∶10 mL、1 g ∶12 mL、1 g ∶14 mL的料液比，加入0.05 mol/L PB（pH值=7.6），超聲波振蕩 20 min 后，在4 ℃冰箱中進行浸提，設定提取時間為 18 h；浸提液經4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于 6 000 r/min 離心20 min，將得到的上清液分別利用96孔“V”形板反應法和考馬斯亮藍G-250法進行血凝檢測和蛋白質含量測定，確定最佳料液比。

1.3.4.4提取時間的確定準確稱取10 g豆粉，按照料液比1 g ∶10 mL，加入0.05 mol/L PB（pH值=7.6），超聲波振蕩20 min后，在4 ℃冰箱中進行浸提，分別設定提取時間為16、18、20、22、24 h；浸提液經4層紗布過濾后，將上清液倒入離心管中，于8 000 r/min離心20 min，將得到的上清液分別利用96孔“V”形板反應法和考馬斯亮藍G-250法進行血凝檢測和蛋白質含量測定，確定最佳提取時間。

1.3.5響應面試驗設計在單因素試驗基礎上，采用 Design-Expert 7.0軟件應用響應面分析法，以料液比（A）、提取時間（B）和pH值（C）為主要影響因素，以特異性活力為（Y）為響應值，設計3因素3水平試驗（表1），選用Box-Behnken通過試驗數據擬合響應面模型，對單因素試驗結果進行響應面試驗，研究工藝條件對提取效果的影響。每個試驗組合重復試驗3次，取其平均值作為結果，試驗結果采用 Design-Expert 7.0軟件分析，確定最佳工藝路線。

1.3.6白蕓豆凝集素的硫酸銨分級沉淀法純化將白蕓豆豆粉與提取劑混合，置于4 ℃冰箱，將溶液進行超聲波振蕩，抽提24 h，用4層紗布過濾，棄去濾渣，濾液于10 000 r/min離心15 min，收集上清液；向上清液中加入固體硫酸銨至40%飽和度，置于4 ℃冰箱12 h，然后于10 000 r/min離心 15 min；收集上清液后，逐漸加固體硫酸銨至溶液70%飽和度，4 ℃靜置12 h后于10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，將沉淀溶于提取劑，透析、冷凍干燥，得到白蕓豆凝集素粗提物，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.7白蕓豆凝集素的柱層析純化（1）DEAE A-50的預處理。稱取5 g A-50，懸于500 mL蒸餾水中，1 h后倒去上層細粒；再按1 g A-50加15 mL 0.5 mol/L NaOH的比例，將A-50浸泡于0.5 mol/L NaOH中，攪勻，靜置30 min，反復用蒸餾水洗至pH值呈中性；再用0.5 mol/L HCl同以上操作過程進行處理；最后用0.5 mol/L NaOH再處理1次，放于電熱爐上煮沸30 min進行脫氣處理，處理完后將A-50浸泡于pH值7.5的PB中過夜。（2）裝柱。將PB緩沖溶液沿玻璃棒倒入柱中約1/4高度，再倒入預處理后與上樣緩沖液調成稀糊狀的A-50，待A-50凝膠沉降2～3 cm厚時，開啟出水口螺旋夾，控制流速1 mL/min，同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度；關閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，塞緊柱上口；平衡：開啟出水口螺旋夾，控制流速12～14 d/min，使約2倍體積的洗脫液流出。（3）Sephadex G-75凝膠預處理。100 mL燒杯中稱取5 g G-75，加入50 mL去離子水，浸泡溶脹24 h；隨后倒去Sephadex G-75溶脹后凝膠上層的清水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH溶液處理，用攪拌棒輕輕攪動，并浸泡1 h后倒去上層液體，再用蒸餾水洗滌，洗滌過程中用傾去法除去細顆粒，其方法是將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌以防止顆粒破碎）并放置數分鐘；將未沉淀的細顆粒隨上層的水倒掉，重復3～5次，直至上層沒有細顆粒為止，再浸泡于水中至中性；將G-75凝膠水溶液放于電熱爐上進行煮沸脫氣處理30 min。裝柱方法類似DEAE A-50陰離子柱。平衡后即可正常使用。

1.3.8SDS-PAGE分析方法SDS-PAGE采用Laemmli的方法[20]，不連續垂直板狀凝膠電泳。白蕓豆凝集素電泳條件：濃縮膠5%，分離膠12%。（1）試劑的配制。10% SDS：將 10 g SDS加水定容至100 mL。10%過硫酸銨：0.1 g過硫酸銨加1.0 mL水，混勻，使用前配制。丙烯酰胺單體貯液：29.10 g 丙烯酰胺+0.90 g N，N-甲叉雙丙烯酰胺加水定容至100 mL，用棕色瓶于4 ℃保存。分離膠緩沖貯液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH值8.8）：將18.15 g Tris溶于 80 mL 水，用4 mol/L HCl調pH值至8.80，定容至100 mL，4 ℃ 保存。濃縮膠緩沖貯液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH值 6.8）：將12.10 g Tris溶于60 mL水，用4 mol/L HCl調pH值至6.80，定容至100 mL，4 ℃保存。樣品緩沖液：1% SDS，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L β-巰基乙醇，0.1 g/L溴酚藍，150 g/L蔗糖，pH值8.0，4 ℃保存。電泳緩沖液：3.0 g Tris+14.4 g甘氨酸（gly）+1.0 g SDS，加水定容至 1 000 mL，4 ℃保存。脫色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL 純水。染色液：2.5 g考馬斯亮藍R-250，454 mL甲醇，92 mL冰乙酸，454 mL純水。

（2）操作方法。每次電泳時，樣品和marker須在沸水浴中保持5 min，然后在常溫下進行電泳。電泳結束后將凝膠小心放入容器中加入染色液，染色結束后用脫色液在脫色搖床上脫色，其間更換脫色液3～4次直到條帶清晰。凝膠的組分見表2，膠板大小為80 mm（W）×73 mm（H）×0.75 mm（T）。

2結果與分析

2.1提取條件優化單因素試驗

2.1.1不同提取劑對白蕓豆凝集素特異性活力的影響由圖1可見，提取液種類的不同對白蕓豆凝集素特異性活力有明顯影響，PB組的凝集素特異性活力明顯高于Tris-HCl組、生理鹽水組、去離子水組，這可能與凝集素是一種水溶性的蛋白質或者糖蛋白有關，蛋白質在具有一定離子強度的浸提劑中的溶解度要高于在去離子水中的溶解度，而 Tris-HCl組有更多的雜蛋白溶解出來，對進一步的分離純化造成負擔，導致凝集素含量下降。因此，確定PB作為提取液。

2.1.2pH值對白蕓豆凝集素特異性活力的影響由圖2可見，pH值從6.4增加至7.6過程中，隨pH值的不斷上升，白蕓豆凝集素的特異性活力值也逐漸增大，這可能是由于凝集素作為一種蛋白質，是一種兩性解離的物質，當提取劑pH值接近凝集素的等電點時，會使凝集素發生沉淀，導致對應的特異性活力值較低；當pH值為7.6時，特異性活力達到最大值，為1 179.661 HU/mg，說明在此pH值條件下，有利于更多的凝集素溶出。因此，確定pH值為7.6為最佳提取液pH值。

2.1.3料液比對白蕓豆凝集素特異性活力的影響從圖3可見，隨著料液比的增加，凝集素的特異性活力也發生明顯的變化，總體呈先提高后降低趨勢；在料液比1 g ∶10 mL時白蕓豆凝集素的特異性活力達到峰值，在料液比較低的時候，白蕓豆凝集素的特異性活力較低。究其原因，可能是當料液比較低時，由于提取劑的濃度不夠，導致蛋白質不能完全被提取，隨著料液比的增加，傳質動力增加，蛋白質的提取率也就隨之上升，相應的凝集素特異性活力提高。因此，從原料的成本考慮，選擇提取料液比1 g ∶10 mL比較適宜。

2.1.4提取時間對白蕓豆凝集素特異性活力的影響從圖4可見，隨著提取時間的延長，凝集素活力先上升后下降，時間為18 h時，達到峰值。說明利用提取劑提取豆粉中的凝集素時，時間的延長有利于凝集素的溶出；但是，提取時間并不是越長越好，過度的時間延長可能會導致豆粉中的一些酶類將蛋白質分解，同時由于微生物的存在，它們的生長繁殖也會消耗一些蛋白質，而這些損失掉的蛋白質中有可能含有凝集素；此外，時間越長，成本越高，因此選擇凝集素活力表現最佳的階段進行提取。由此可見，提取時間為18 h比較合適。

2.2響應面法優化提取條件

2.2.1響應面曲面試驗設計與結果在單因素試驗的基礎上，以特異性活力（Y）為響應值，根據Design-Expert 7.0的中心組合設計原理，設計3因素3水平響應面分析試驗，以料液比（A）、提取時間（B）、pH值（C）為主要影響因素，響應面試驗設計見表1，結果見表3，對該回歸模型及系數進行顯著性檢驗的結果見表4。

運用Design-Expert 7.0數據統計分析軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合，得到多元二次回歸方程：

Y=411.13+7.19A+41.65B-31.21C-3.69AB-6.65AC-39.71BC-3.45A2-106.41B2-20.67C2。

由表4可看出，模型P值=0.021 2<0.05，該模型是顯著的；失擬項P值=0.791 6>0.05，差異不顯著；殘差均由隨機誤差引起，表明所建立的回歸二次模型成立，此模型可用作預測和分析白蕓豆凝集素提取工藝參數。依據回歸系數模型顯著性檢驗可知，在選定的范圍內，影響蛋白質提取率的主次因素為B>C>A，即提取時間>pH值>料液比；模型的R2=0.868，模型擬合程度很好。

2.2.2響應面分析為進一步研究相關變量之間的交互作用，通過Design-Expert 7.0統計軟件繪制響應面曲面進行直觀分析。從圖5-A中可以看出，料液比對凝集素特異性活力的影響呈現線性關系，而提取時間呈二次影響；隨著料液比的不斷升高，凝集素特異性活力沒有表現明顯的變化；而隨著提取時間的不斷增加，凝集素特異性活力呈現出先增強后減弱的趨勢。從圖5-B中可以看出，料液比對凝集素特異性活力的影響呈現線性關系，而pH值呈二次影響；隨著料液比的不斷升高，凝集素特異性活力沒有表現明顯的變化；而隨著pH值的不斷上升，凝集素特異性活力呈現出先提高后降低的趨勢。從圖5-C中可以看出，pH值和提取時間對凝集素特異性活力都呈二次影響，隨著提取時間的增加，凝集素特異性活力呈現先增強后減弱的趨勢；隨著pH值的增加，凝集素特異性活力同樣呈先增強后減弱趨勢，說明兩者的交互作用對蛋白質的提取率均有影響。

綜合分析圖5-A、圖5-B、圖5-C可以看出，提取時間和pH值變化時，響應值變化較大，表現為曲線較陡；提取時間和pH值對凝集素的特異性活力影響較明顯，料液比影響不大。

2.2.3驗證試驗對回歸模型進行參數優化，分析得到白蕓豆凝集素提取最優工藝參數為料液比1 g ∶10 mL，pH值7.5，提取時間20 h，特異性活力可達到1 209.04 HU/mg。為了驗證試驗預測結果，用以上優化參數重復試驗3次，平均特異性活力為1 193.62 HU/mg，與理論值偏差1.3%，沒有明顯差異，試驗結果證明，響應面分析法對工藝優化是非常有效的。

2.2.4DEAE A-50陰離子交換層析離子交換層析利用帶電分子之間的電荷差異來進行分離。蛋白質是一種兩性電解質，當蛋白質所處環境的pH值發生變化時會引起蛋白質本身所帶電荷的變化。當蛋白質所處的環境pH值>等電點（pI）時，帶負電；當環境的pH值

將凝集素粗品溶液用水系膜除雜，用pH值7.5、0.05 mol/L PB作為上樣緩沖液，紫外檢測器檢測平穩后開始工作。上樣量為3 mL，經緩沖溶液洗脫獲得第1個吸收峰。然后按照NaCl濃度0.05、0.20、0.50 mol/L的變化梯度進行梯度洗脫。各濃度梯度洗脫后得到的洗脫結果見圖6，其中峰1為PB洗脫液直接洗脫獲得的穿透峰，峰2為添加 0.05 mol/L NaCl的PB洗脫峰，峰3為添加0.20 mol/L NaCl的PB洗脫峰，峰1具有凝集能力，其余的則不含有凝集素，因此將經過洗脫后獲得的峰1溶液保存備用。

2.2.5Sephadex G-75分子篩分子篩層析是依據樣品中物質分子的差別而進行分離的，洗脫時分子量大的物質直接被沖洗下來，而分子量小的在洗脫時會進入凝膠孔內增加運行的距離，使得大分子量的先洗脫下來，小分子量的后洗脫下來，從而實現目標產物的分離。將DEAE A-50純化后的溶液過水系膜后上Sephadex G-75 分子篩柱。用pH值7.5、005 mol/L PB作為上樣緩沖液，上樣量5mL。得到如圖7所示的洗脫結果，經血紅細胞檢測表明，該凝集素具有凝集活力。

2.2.6SDS-PAGE檢測分析通過對比標準分子量蛋白各條帶對應的分子量，得知目標蛋白的分子量大小在30～40 ku（圖8）。

3結論

用Design-Expert 7.0統計軟件，根據單因素試驗和響應面分析試驗對白蕓豆粗凝集素提取工藝進行優化，采用響應面法對白蕓豆凝集素提取方法進行優化，得到擬合方程：Y=411.13+7.19A+41.65B-31.21C-3.69AB-6.65AC-3971BC-3.45A2-106.41B2-20.67C2，以及提取最優條件：料液比1 g ∶10 mL，pH值7.5的0.05mol/LPB，提取時間

20 h，白蕓豆凝集素特異性活力為 1 193.62 HU/mg。白蕓豆凝集素粗品，經過DEAE A-50、Sephadex G-75分子篩及SDS-PAGE分析后表明，初步分離產物中白蕓豆凝集素的分子量在30～40 ku，含量較高。

參考文獻：

[1]王克夷，許強. 凝集素和毒素[J]. 生物化學與生物物理學報，2002，32（3）：201-205.

[2]Lavelle E，Grant G，Pusztai A，et al. Mucosal immunogenicity of plant lectins in mice[J]. Immunology，2000，99（1）：30-37.

[3]羅德生，顧熊飛，馬澗泉. 凝集素研究進展[J]. 醫學綜述，1996，2（3）：119-121.

[4]孫冊，朱政，莫漢慶. 凝集素[M]. 北京：科學出版社，1986：1-52.

[5]柯佳穎，陳寅山，饒小珍. 凝集素及其生物學作用[J]. 寧德師專學報（自然科學版），2005，17（1）：19-22.

[6]Sharon N，Lis H. Legume lectins——a large family of homologous proteins[J]. The FASEB Journal，1990，4（14）：3198-3208.

[7]Branco A，Bernabé R，Dos Santos Ferreira B，et al. Expression and purification of the recombinant SALT lectin from rice （Oryza sativa L.）[J]. Protein Expression and Purification，2004，33（1）：34-38.

[8]Lannoo N，Vervecken W，Proost P，et al. Expression of the nucleocytoplasmic tobacco lectin in the yeast Pichia pastoris[J]. Protein Expression and Purification，2007，53（2）：275-282.

[9]Nomura K，Ashida H，Uemura N，et al. Purification and characterization of a mannose/glucose-specific lectin from Castanea crenata[J].Phytochemistry，1998，49（3）：667-673.

[10]Loris R，Hamelryck T，Bouckaert J，et al. Legume lectins tructure[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1988，1383（1）：9-36.

[11]李鋒，王競，趙曉軍. 小白蕓豆凝集素的分離純化及性質研究[J]. 鄭州大學學報（理學版），2010，42（1）：120-124.

[12]徐維艷，王衛東，秦衛東. 花生蛋白的制備、功能性質及應用[J]. 食品科學，2010，31（17）：476-479.

[13]魏鵬娟，王魯峰，徐曉云，等. α-淀粉酶蛋白類抑制劑的研究進展[J]. 食品科學，2011，32（9）：312-318.

[14]趙蓉，李多偉，沈曉東，等. 白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的研究[J]. 中成藥，2008，30（9）：1355-1357.

[15]呂鳳霞，陸兆新. α-淀粉酶抑制劑的研究進展[J]. 食品科學，2002，23（3）：152-155.

[16]張曉琦，楊明琰，馬瑜，等. 白豆α-淀粉酶抑制劑糖蛋白的提取純化及降血糖活性研究[J]. 藥物生物技術，2007，14（6）：406-410.

[17]王孝平，邢樹禮. 考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J]. 天津化工，2009，23（3）：40-42.

[18]李笑梅. 菜豆凝集素提取方法的研究[J]. 食品科學，2008，29（10）：263-266.

[19]楊明亮，王繼安. 大豆凝集素含量測定及聚類分析[J]. 大豆科技，2009（5）：20-23.

[20]Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970，227（5259）：680-685.岳有軍，趙文佳，趙輝，等. 基于多顏色通道組合的UVI空間農作物陰影去除方法[J]. 江蘇農業科學，2017，45（6）：196-200.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.051