云南小粒種咖啡果皮粗提物提取工藝優化

張云鶴，付曉萍，林 奇，楊 艷，韓中惠，尹 雄，范江平

（云南農業大學食品科技學院，云南昆明650201）

云南小粒種咖啡果皮粗提物提取工藝優化

張云鶴，付曉萍，林 奇，楊 艷，韓中惠，尹 雄，*范江平

（云南農業大學食品科技學院，云南昆明650201）

云南小粒種咖啡果皮粗提物含有花色苷，具有較好的抗氧化活性。利用響應曲面法，研究云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取工藝。在單因素試驗的基礎上，以提取時間、提取溫度、提取劑質量分數及料液比為自變量，采用響應曲面法研究各因素及其交互作用對云南小粒種咖啡果皮粗提物提取的影響。模擬得到云南小粒種咖啡果皮粗提物提取工藝的回歸方程，確定了提取工藝的最佳提取條件為提取時間120 min，提取溫度40℃，提取劑質量分數80%，料液比1∶20。在此提取工藝下可以較好地對云南小粒種咖啡果皮粗提物進行提取，為后期花色苷分離作好準備。

云南小粒種咖啡；咖啡果皮提取工藝；響應曲面

0 引言

云南省是我國主要的咖啡種植地，主要種植的品種是小粒種咖啡，也稱為云南小粒種咖啡[1-3]。由于云南省地形起伏較大，多以山區地形為主，空氣濕度較大，日照時間長，晝夜溫差較大，這些自然條件使云南省成為種植小粒種咖啡的絕佳地帶之一，種植的小粒種咖啡酸味適中、香味濃郁醇和[4-5]。近年來，云南省政府和有關部門大力扶植云南咖啡產業的發展，2014年星巴克正式入駐昆明，也促進了咖啡產業的發展[6]。在咖啡制作過程中，咖啡果皮一般作為廢棄物被丟棄[7]，不但造成了資源的浪費，也對環境造成了污染。研究表明，咖啡果皮粗提物中含有花色苷，具有較好的抗氧化活性[8]。目前，對咖啡果皮提取物的報道還不多，因此針對咖啡果皮提取工藝研究具有一定的必要性。

試驗對云南小粒種咖啡果皮采用有機溶劑浸提的方法，通過單因素試驗法分析提取劑質量分數、提取時間、提取溫度、料液比和提取次數等因素對云南小粒種咖啡果皮粗提物提取效果的影響，并采用響應曲面分析得到最佳的提取條件，為進一步開發利用咖啡果皮提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南小粒種咖啡，購于云南省普洱市北歸咖啡有限公司；甲醇，西隴化工股份有限公司提供；乙醇，天津風船化學試劑科技有限公司提供；鹽酸，重慶川東化工集團有限公司提供。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW-200型高速萬能粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司產品；TSX-200型超聲波清洗機，天實中美（北京）科技有限公司產品；FD-1D-50型真空冷凍干燥機、電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；RE-2000A型旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司產品；T6型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取工藝

挑選新鮮的咖啡果，通過剝皮得到咖啡果皮，在真空冷凍的條件下進行干燥；利用粉碎機粉碎得到咖啡果皮粉，通過提取劑的浸提，離心后過濾；取上清液進行旋轉蒸發，得到濃縮液；在真空冷凍的條件下干燥，得到咖啡果皮粗提物。

1.3.2 提取劑和最佳波長的選擇

選擇pH值分別為2，3，4，5的HCl-甲醇和HCl-乙醇溶液為提取劑，稱取1 g咖啡果皮干粉；采用料液比1∶50于室溫下超聲波浸提1 h的方法，對其以轉速3 000 r/min離心5 min；取上清液，確定最佳提取劑及最佳吸收波長。

1.3.3 單因素試驗

根據已確定的最佳提取劑，稱取1 g咖啡果皮濃縮干粉，加入提取液，超聲波浸提一定時間，對其以轉速3 000 r/min離心5 min。取上清液，用紫外可見分光光度計在最佳波長下測定吸光度，觀察在不同條件下對云南小粒種咖啡果皮粗提物提取的影響。

1.3.4 響應曲面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以提取時間、提取溫度、提取劑質量分數、料液比4個參數為自變量（分別以X1，X2，X3，X4表示），按方程Xi=（Xi'-X0）/ΔX對自變量進行編碼。式中，Xi為變量的編碼值；Xi'為變量的真實值；X0為試驗中心點變量的真實值；ΔX為變量的變化步長。以吸光度為響應值，每個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1，0，1進行編碼；設計四因素三水平的響應曲面分析試驗，對提取工藝進行優化試驗設計，確定最優提取工藝，并針對響應曲面試驗結果進行驗證試驗。

響應曲面法分析因素及水平設計見表1。

表1 響應曲面法分析因素及水平設計

2 結果與分析

2.1 提取劑和最佳波長的選擇

咖啡果皮粗提物在不同提取劑中的吸光度見圖1。

圖1 咖啡果皮粗提物在不同提取劑中的吸光度

由圖1可知，咖啡果皮粗提物在HCl-甲醇中溶解度好于在HCl-乙醇中的溶解度，其中在pH值為5時的HCl-甲醇中溶解度最好。

咖啡果皮粗提物紫外-可見光吸收光譜見圖2。

圖2 咖啡果皮粗提物紫外-可見光吸收光譜

根據圖2紫外-可見光170～700 nm的掃描結果可知，咖啡果皮粗提物的最大吸收波長為534 nm。這與王艷龍測定的矢車菊素標準品紫外可見光譜掃描得到的最佳吸收波長相接近，經后期試驗驗證可知咖啡果皮粗提物含有矢車菊素類物質[8]。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同質量分數的提取劑對提取效果的影響

選擇質量分數為20%，40%，60%，80%，100%的甲醇（pH值為5）作為提取劑進行單因素試驗，于波長534 nm處測定吸光度。結果表明，當甲醇質量分數為80%時吸光度達到最大。因此，選擇質量分數為80%的甲醇（pH值為5）作為咖啡果皮提取劑。

2.2.2 料液比對提取效果的影響

選擇料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g∶mL）進行單因素試驗，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，于波長534 nm處測定吸光度。結果表明，吸光度隨料液比的增加而呈現逐漸減小的趨勢，料液比1∶20之后下降幅度減緩。綜合考慮成本和實際情況等因素，確定料液比為1∶20。

2.2.3 提取溫度對提取效果的影響

選擇提取溫度20，30，40，50，60℃進行單因素試驗，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，料液比1∶20，于波長534 nm處測定吸光度。結果表明，隨著提取溫度的升高，吸光度呈逐漸上升的趨勢，當提取溫度為40℃時吸光度最大，提取效果最好。

2.2.4 提取時間對提取效果的影響

選擇提取時間30，60，90，120，150 min進行單因素試驗，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，料液比1∶20，提取溫度40℃，于波長534 nm處測定吸光度。結果表明，隨著提取時間的延長，吸光度增大，在120 min和150 min時相差不大，綜合考慮選擇提取時間為120 min。

2.2.5 提取次數對提取效果的影響

選擇提取次數1，2，3次進行單因素試驗，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，料液比1∶20，提取溫度40℃，提取時間120 min，于波長534 nm處測定吸光度。結果表明，吸光度隨提取次數的增加而呈現顯著下降的趨勢，第1次提取時的吸光度最大，說明1次已經基本提取完全，因此提取次數為1次。

2.3 響應曲面試驗

2.3.1 響應曲面設計及試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，確定提取次數為1次，以吸光度為響應值，采用統計分析軟件Design Expert 8.0建立四因素三水平的Box-Behnken模型設計方案，進行進一步的優化試驗，共29組試驗。

響應曲面試驗設計及結果見表2。

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗

利用Design Exper 8.0軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合，得到云南小粒種咖啡果皮粗提物對提取時間、提取溫度、提取劑質量分數和料液比的二次多項回歸模型方程為：

回歸模型方差分析及模型系數顯著性檢驗見表3。

由表3方差分析可知，模型p≤0.000 1＜0.01表明回歸模型極顯著；失擬項p=0.165 2＞0.05，模型失擬項不顯著；R2=0.903 8，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以用此模型對云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取進行分析和預測。從表3可知，模型一次項X1，X2不顯著，X3顯著，X4極顯著；二次項都是極顯著；交互項都不顯著，說明不同的提取工藝與云南小粒種咖啡果皮粗提物的吸光度不是簡單的線性關系。

2.3.3 響應曲面交互作用分析

表2 響應曲面試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析及模型系數顯著性檢驗

根據表3回歸分析的結果，做出模型的響應曲面圖。

圖3 提取時間、提取溫度、提取劑質量分數、料液比兩兩因素之間對吸光度影響的響應曲面

提取時間、提取溫度、提取劑質量分數、料液比兩兩因素之間對吸光度影響的響應曲面見圖3。

圖3中直觀的反映了各因素對響應值的影響，圓形表示2個因素之間的交互作用不顯著，而橢圓形表示2個因素之間的交互作用顯著。

由圖3（a）可知，隨著提取時間和提取溫度的增加，吸光度呈現先增加后下降的趨勢。當提取劑質量分數和料液比為最佳值時，提取時間和提取溫度在120 min，40℃時可得到吸光度的最大值。圖3（b）表明，隨著提取時間和提取劑質量分數的增加，吸光度呈現先增加后下降的趨勢。當提取溫度和料液比為最佳值時，提取時間和提取劑質量分數分別為120 min，76%～84%時可得到吸光度的最大值。圖3（c）顯示，在最優提取溫度和提取劑質量分數條件下，提取時間和料液比對咖啡果皮粗提物吸光度的響應結果。當提取溫度和提取劑質量分數為最佳值時，提取時間和料液比分別為120 min，1∶20時可得到吸光度的最大值。圖3（d）表明，隨著提取溫度和提取劑質量分數的增加，吸光度呈現先增加后下降的趨勢。當提取時間和料液比為最佳值時，提取溫度和提取劑質量分數分別為40℃，76%～84%時可得到吸光度的最大值。圖3（e）表明，在最優提取時間與提取劑質量分數條件下，提取溫度和料液比對咖啡果皮粗提物吸光度的響應結果。當提取時間和提取劑質量分數為最佳值時，提取溫度與料液比分別為40℃，1∶20時可得到吸光度的最大值。圖3（f）表明，在最優提取時間和提取溫度條件下，提取劑質量分數與料液比對咖啡果皮粗提物吸光度的響應結果。當提取時間和提取溫度為最佳值時，提取劑質量分數與料液比分別為76%～84%，1∶20時可得到吸光度的最大值。

2.3.4 云南小粒種咖啡果皮最佳提取工藝條件及驗證試驗

利用Box-Benhnken得到此回歸模型的最優結果為提取時間116.34 min，提取溫度39.62℃，提取劑質量分數75.41%，料液比1∶17，在此條件下咖啡果皮粗提物的吸光度預測值為1.451。根據實際操作的可行性，將最佳工藝條件定為提取時間120 min，提取溫度40℃，提取劑質量分數80%，料液比1∶20，在此條件下進行3次平行試驗，測得的吸光度為1.432，與理論預測值相比，相對誤差較小，說明優化結果可信。

3 結論

通過測定不同pH值的HCl-甲醇和HCl-乙醇溶液于400～700 nm波長之間的吸光度，確定最佳的提取劑為pH值5的HCl-甲醇溶液；測定不同波段的波長，確定最佳的波長為534 nm。

通過單因素試驗，考察了提取劑質量分數、提取時間、提取溫度、料液比、提取次數等因素的不同水平對云南小粒種咖啡果皮粗提物提取效果的影響，選出對咖啡果皮粗提物提取效果有較大影響的因素及其大致范圍。然后在單因素試驗的基礎上，以提取劑質量分數、提取時間、提取溫度、料液比為主要考察因素，以測得的吸光度為主要考察指標，利用響應曲面法的Box-Behnken設計四因素三水平方案和Design Expert 8.0軟件對數據進行分析得到最佳工藝參數為提取時間120 min，提取溫度40℃，提取劑質量分數80%，料液比1∶20。利用響應曲面分析法對云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取工藝進行優化，能較好地進行提取，為云南小粒種咖啡副產物的進一步開發研究奠定基礎。

[1]黃家雄，李貴平.中國咖啡遺傳育種研究進展[J].西南農業學報，2008，21（4）：1 178-1 181.

[2]劉春華，李春麗，徐志.咖啡種類及其病蟲害研究[J].中國熱帶農業，2010（5）：59-61.

[3]黃家雄，李貴平，楊世貴.咖啡種類及優良品種簡介[J].農村實用技術，2009（1）：42-43.

[4]周華，李文偉，張洪波，等.咖啡種質資源的引進、研究及利用[J].云南熱作科技，2002，25（2）：1-6.

[5]李曉霞，張吉光，楊天武，等.云南不同海拔小粒種咖啡生長及發育情況調查[J].云南熱作科技，2002，25（4）：8-16.

[6]楊瑞娟.云南小粒種咖啡發展現狀與展望[J].農業實用技術，2012（10）：15-16.

[7]何紅艷，文志華，李國鵬.咖啡采后處理及初加工技術[J].廣東農業科學，2008（12）：119-120.

[8]張云鶴，付曉萍，梁文娟，等.云南小粒種咖啡果皮粗提物花青素成分及抗氧化活性研究[J].食品科技，2016，41（5）：219-222.◇

Optimization of the Extraction Technology of Crude Extracts from Yunnan Arabica Coffee Husk via Response Surface Methodology

ZHANG Yunhe，FU Xiaoping，LIN Qi，YANG Yan，HAN Zhonghui，YIN Xiong，*FAN Jiangping
（College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China）

Yunnan Arabica coffee husk extractant possessed anthocyanin，which has antioxidant activity.The extraction technology of the crude extracts of Yunnan Arabica coffee husk is studied by response surface methodology.On the basis of single factor test，selecting the extraction time and temperature，concentration and solid-liquid ratio as independent variables，the effect of these factors and their interaction on Yunnan Arabica coffee husk extracts are studied by response surface method. The regression equation of Yunnan Arabica coffee husk extracts extraction is simulated，as well as the optimum extraction conditions for the extraction process.The extraction process are determined：extraction time 120 min，extraction temperature 40℃，extractant concentration 80%，solid-liquid ratio 1∶20.The processing can be preferably extracted Yunnan Arabica coffee husk extractant as well as prepared for isolating anthocyanin.

Yunnan Arabica coffee；extraction processing；response surface methodology

TS209

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.009

1671-9646（2017）03a-0029-04

2017-02-08

云南省教育廳重大專項（ZD2014007）。

張云鶴（1990—），女，碩士，研究方向為農產品貯藏及加工工程。

*通訊作者：范江平（1972—），男，博士，教授，研究方向為食品科學教學和研究。