高效液相色譜檢測番茄與土壤中的吩胺霉素殘留

劉紅玉　陳夢現(xiàn)　歐曉明　付啟明　文珊

摘 要：吩胺霉素是我國具有自主知識產權的新型抗生素類殺菌劑.選取番茄及三類理化性質不同的土壤為研究對象，建立了吩胺霉素在上述基質中的液相色譜檢測方法.土壤中吩胺霉素選擇混合液（V氨水∶V乙醇∶V二氯甲烷=1∶2∶3）振蕩提取，番茄中吩胺霉素采用乙腈振蕩提取，堿性氧化鋁柱凈化.土壤與番茄中的平均回收率分別為80.2%～95.7%和80.1%～85.6%，RSD（相對標準偏差）分別為2.14%～4.17%和4.12%～5.17%.吩胺霉素的最小檢出量為0.2 ng，在基質中最低檢測限為0.01 mg/kg.本方法簡單可靠，基質效應弱，符合農藥殘留分析要求，可用于土壤和番茄中吩胺霉素的殘留檢測.

關鍵詞：吩胺霉素；番茄；土壤；高效液相色譜；基質效應

中圖分類號：X592 文獻標識碼：A

Abstract：Phenazine1carboxamide is a new pesticide. This paper evaluates the residue of phenazine1carboxamide in tomato and three kinds of soils. New methods for determining phenazine1carboxamide residue in these matrices were developed by high performance liquid chromatography detection. Phenazine1carboxamides from soil with ammonia water + ethanol + dichloromethane = 1+2+3（v/v） and from tomato with acetonitrile were exacted， followed by chromatography columns （basic aluminum） cleanup. The mean recoveries of phenazine1carboxamide in soil and tomato were 80.2% to 95.7% and 80.1% to 85.6% respectively， while the relative standard deviations were 2.14% to 4.17% and 4.12% to 5.17%， respectively. The minimum detectable quantity of phenazine1carboxamide was 0.2 ng， and the limit of detection was 0.01 mg/kg. In a whole， this method is simple and reliable， and has weak matrix effects， which satisfies the requirement of pesticide residue analysis. It is applicable to determine the phenazine1carboxamide residues in soil and tomato.

Key words：phenazine1carboxamide； tomatoes； soil； HPLC； matrix effects

農藥可以殺蟲、殺菌、除草，改善作物的生長環(huán)境，為作物生產帶來效益，然而不合理地使用農藥也會帶來環(huán)境風險和經(jīng)濟損失.生物農藥活性成分屬于天然成分，具有對人類和動物安全、難產生生物抗性、可有效控制病蟲害等優(yōu)點[1]，是未來農藥發(fā)展的趨勢.

吩胺霉素是我國具有自主知識產權的新型抗生素類殺菌劑.它由綠針假單胞菌nlsy001（Pseudomonas chlororaphis）通過微生物培養(yǎng)、發(fā)酵、提取而獲得，是一種對多種真菌性植物病害具有良好抑制效果的新型生物農藥.吩胺霉素易溶于丙酮、二氯甲烷、乙醇等有機溶劑，在水中的溶解性較差，化學性質穩(wěn)定，分子式為C13H9N3O，分子量為223.2.

目前國內關于吩胺霉素的研究報告較少.熊件妹等[2]曾研究了吩胺霉素對黃瓜枯萎病的抑制作用.關于吩胺霉素在土壤以及農產品中的殘留檢測方法尚未有報告.高效液相色譜已廣泛應用于環(huán)境基質中有機污染物質的檢測[3].本文選取番茄、3類土壤為研究對象，初步研究吩胺霉素在上述基質中的提取檢測方法，以期為土壤以及農產品中的吩胺霉素的殘留檢測提供科學依據(jù).

1 材料與儀器

1） 儀器：高效液相色譜儀， LC20ADXR（日本島津公司）；AUW220D型分析天平（日本島津公司）；Scout SE型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；RE52A型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HY1B型回旋振蕩器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；SC3614型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），0.22 μm有機相膜.

2） 試劑與樣品：吩胺霉素標準品，95%（農業(yè)部農藥檢定所）；甲醇為色譜級；二氯甲烷、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉均為分析純；堿性氧化鋁（100～200 μm）；稀氨水（V濃氨水∶V純水=1∶9）；番茄來自湖南化工研究院未施用吩胺霉素實驗田； 土壤選擇未被吩胺霉素污染的吉林黑土、北京潮土以及湖南紅土，其理化性質見表1（湖南省化肥農藥質量監(jiān)督檢驗授權站檢測）.

2 實驗標準方法

2.1 標準曲線繪制

稱取0.026 3 g的吩胺霉素標準樣品于50 mL容量瓶中，乙腈定容，配制成500 mg/L的儲備液，使用前保存于4 ℃的冰箱.將儲備液用乙腈配制成質量濃度為0.01 mg/L， 0.05 mg/L， 0.10 mg/L， 0.50 mg/L， 1.00 mg/L， 10.00 mg/L的系列標準溶液，繪制標準曲線.

2.2 基質匹配標準溶液[4]

將提取后的空白樣品基質，添加0.01 mg/L， 0.05 mg/L， 0.10 mg/L， 0.50 mg/L， 1.00 mg/L， 10.00 mg/L系列標準溶液，配制基質匹配標準溶液.

2.3 樣品前處理

2.3.1 樣品制備

用勻漿攪拌機將清洗后的番茄絞碎，用采樣袋收集；土壤取樣深度15 cm，多點均質采樣后混合，經(jīng)自然風干，過40 μm篩，用采樣袋收集，樣品使用前均儲存于4 ℃條件下.

2.3.2 土壤的提取凈化

稱取20 g土壤于150 mL塑料離心瓶，提取液（V氨水∶V乙醇∶V二氯甲烷=1∶2∶3）60 mL振蕩提取40 min，4 000 r/min條件下離心8 min，將上清液過脫脂棉轉移至分液漏斗；殘渣用20 mL二氯甲烷洗滌，洗滌液并入分液漏斗，用二氯甲烷振蕩萃取2次，每次50 mL，分層，合并有機相.有機相過無水硫酸鈉后收集于圓底燒瓶，45 ℃水浴旋轉蒸發(fā)至近干，冷卻后用2 mL乙腈+甲醇（V乙腈∶V甲醇=1∶1）定容，過0.22 μm有機相膜待檢測.

2.3.3 番茄的提取凈化

稱取20 g番茄樣品于150 mL玻璃錐形瓶中，50 mL乙腈振蕩提取40 min，將提取液過脫脂棉轉移至分液漏斗，殘渣用20 mL二氯甲烷洗滌，洗滌液并入分液漏斗，用二氯甲烷振蕩萃取2次，每次50 mL，分層，合并有機相.有機相過無水硫酸鈉后收集于圓底燒瓶，45 ℃水浴旋轉蒸發(fā)至近干，5 m L正己烷溶解，待凈化.

采用干法裝柱，玻璃層析柱中依次裝入2 g無水硫酸鈉、2 g堿性氧化鋁和2 g無水硫酸鈉，并不斷用吸耳球輕輕敲打至填充密實.10 mL正己烷預淋層析柱后上樣，用15 mL正己烷+二氯甲烷（體積比為8∶2）混合液淋洗，棄去淋洗液，繼續(xù)用150 mL乙酸乙酯洗脫目標物，洗脫液收集于圓底燒瓶中，于45 ℃水浴旋轉蒸發(fā)至近干，2 mL乙腈+甲醇（體積比1∶1）定容，過0.22 μm有機相膜待檢測.

2.4 儀器條件

2.4.1 高效液相色譜條件

色譜柱為WelcholtimateAQGg，150 mm×4.6 mm；柱溫40 ℃，檢測器為PDA，檢測波長254 nm；流動相：甲醇水（體積比49∶51， 10 min），甲醇水（體積比95∶5， 5 min），甲醇水（體積比49∶51， 5 min）；進樣量20 μL.吩胺霉素保留時間9 min左右，標準品色譜圖如圖1所示.

2.4.2 檢測條件的確定

通過檢測器全掃描發(fā)現(xiàn)吩胺霉素在254 nm處有較強的吸收峰，且對目標物沒有干擾，故選擇為檢測波長.

以甲醇與水體積比為49∶51，目標物可以較早出峰，峰型較好，且能與雜質完全分離，故選擇為流動相.

3 結果與討論

3.1 標準曲線

取0.01 mg/L， 0.05 mg/L， 0.10 mg/L， 0.50 mg/L， 1.00 mg/L， 10.00 mg/L質量濃度的系列標準溶液，在測定條件下，以峰面積（y）進樣質量濃度（x）作標準曲線，得到儀器對吩胺霉素響應的線性關系.測得吩胺霉素標準曲線方程為y=234 578x-1 253.5（R2=1）.

3.2 添加回收實驗

稱取番茄及3類土壤空白樣品，添加吩胺霉素標準品，分別做0.01 mg/kg， 0.10 mg/kg， 1.00 mg/kg三個添加水平，每個水平重復5次，按上述分析方法提取、凈化并做HPLC測定，計算添加回收率，結果見表2.在上述檢測條件下，吩胺霉素各樣本典型色譜圖見圖2.

根據(jù)上述檢測條件，得到吩胺霉素最小檢出限為0.2 ng，在土壤和番茄中的最低檢測限為0.01 mg/kg.3類土壤與番茄中的平均回收率分別為80.2%～95.7%和80.1%～85.6%，RSD分別為2.14%～ 4.17%和4.12%～5.17%.采用的方法滿足農藥殘留分析標準[5]，為該農藥檢測提供了參考方法.

3.3 土壤的提取

依據(jù)地理位置、物理化學性質的不同，選取了吉林黑土、北京潮土和湖南紅土3種典型土壤，確定了適合3類土壤的吩胺霉素提取方法，并探討了土壤性質與稱樣量對回收率的影響.

3.3.1 提取溶劑的選擇

吩胺霉素在丙酮、乙醇、甲醇、乙腈中的溶解性較好，但單獨使用以上溶劑，回收率均低于55%（表3），這可能是由于極性較強的單一溶劑不能解吸出土壤中的吩胺霉素.使用二氯甲烷作為提取溶劑，回收率有所增加，但仍低于60%，可能是因為土壤中含有一定量的水分，二氯甲烷無法完全浸入土壤孔隙.使用極性溶劑乙醇或甲醇與二氯甲烷的混合提取劑可有效浸入土壤，溶解農藥，回收率明顯增加（見表3）.由于乙醇毒性低，且與二氯甲烷混合后回收率更高，故作為最終提取溶劑.

上述實驗表明，無論單獨使用極性還是非極性溶劑提取，回收率均較低，采用極性與非極性溶劑混合液有利于提取，結論與 Gans[6]和Hussen[7]的結果一致.

土壤pH值對農藥的吸附也存在影響[8].為了進一步提高回收率，本文對比了中性條件與堿性條件下的提取，發(fā)現(xiàn)堿性條件有利于提取（見表3）.最終確定混合液（V氨水∶V乙醇∶V二氯甲烷=1∶2∶3）60 mL作為提取溶劑.

3.3.2 土壤性質對回收率的影響

回收率與土壤的有機質含量有關，有機質含量越高對農藥的吸附性越強[9-10]，越不利于提取.吩胺霉素在3種土壤（理化性質見表1）中的添加回收率，從低到高的順序為吉林黑土<北京潮土<湖南紅土；有機質含量從高到底的順序為吉林黑土>北京潮土>湖南紅土，兩者呈負相關性，R2為0.584 7～0.730 1.

Kodesova等[11]發(fā)現(xiàn)農藥在土壤中的吸附與陽離子代換量有顯著的正相關性，影響回收率.吩胺霉素在土壤中的回收率與陽離子代換量也成反比關系，黑土的陽離子代換量最高，回收率最低，湖南紅土的陽離子代換量最低，回收率最高，R2為0.946 3～0.993 6.

土壤黏粒對某些農藥的吸附影響甚至比有機質等其他因素的影響更大[12].本研究發(fā)現(xiàn)回收率與土壤黏粒呈負相關性，R2為0.590 6～0.735 4，黏粒含量增加會導致土壤中吩胺霉素的吸附性增大，造成回收率降低.

3.3.3 土壤質量對回收率的影響

研究了5 g， 10 g， 20 g吉林黑土添加0.1 mg/kg吩胺霉素的添加回收.發(fā)現(xiàn)土壤稱樣量越大，回收率越低，5 g樣品的回收率為86.1%，10 g樣品的回收率為84.6%，20 g樣品的回收率為82.5%.原因可能在于土壤越多，不飽和吸附位點越多，被吸附的農藥越多；同時相同體積的提取劑無法有效浸入質量較大的土壤空隙，解吸出農藥.

3.4 番茄的提取

3.4.1 提取溶劑的選擇

由于乙腈提取時的共萃物較少，且在鹽溶液中與水容易分離，經(jīng)常作為首選提取溶劑[13].實驗對比了乙腈、甲醇、丙酮的提取結果，在回收率相近的情況下，乙腈提取雜質最少，最終確定乙腈為提取溶劑.

3.4.2 凈 化

吸附劑的選擇：試驗對比了弗羅里硅土、硅膠、堿性氧化鋁、活性炭/堿性氧化鋁（1∶200）對番茄樣品的凈化效果.結果發(fā)現(xiàn)：弗羅里硅土與硅膠作為吸附劑，乙酸乙酯洗脫出雜質產生干擾.活性炭/堿性氧化鋁（1∶200）雖然可以去除雜質，但活性炭的吸附能力過強，乙酸乙酯、甲醇或二氯甲烷均無法有效地將目標物洗脫下來.堿性氧化鋁可以有效地吸附雜質，同時乙酸乙酯可以將目標物洗脫，最終確定堿性氧化鋁作為吸附劑.

洗脫溶劑：用堿性氧化鋁作吸附劑，正己烷無法有效洗脫出雜質；用二氯甲烷預淋洗時，會將部分目標物與雜質共同洗脫；使用正己烷+二氯甲烷（V正己烷∶V二氯甲烷=8∶2）混合液可以洗脫雜質，同時目標物可以保留于層析柱中，達到目標物與雜質分離的效果.預淋后，用二氯甲烷和乙酸乙酯繼續(xù)洗脫，均可將目標物洗脫，不產生干擾；而甲醇作洗脫溶劑，能洗脫出乙酸乙酯無法洗脫的雜質，產生干擾.由于乙酸乙酯洗脫效果較二氯甲烷好，所以選擇乙酸乙酯作為洗脫溶劑.

淋洗體積：對比了120 mL和150 mL的乙酸乙酯洗脫回收率.當用120 mL乙酸乙酯洗脫時，平均回收率為84.7%，用150 mL乙酸乙酯洗脫時，平均回收率為92.7%，所以最后以150 mL乙酸乙酯淋洗目標物.

3.5 基質效應

采用色譜檢測時，可能會產生基質效應.本文使用相對響應值法來評價基質效應.計算公式如下：

基質效應值=B/A×100%.

式中： A 為溶劑中農藥的響應值；B為空白基質中農藥的響應值.

提取后的基質空白分別添加了0.01 mg/L，0.05 mg/L， 0.10 mg/L， 0.50 mg/L， 1.00 mg/L和10.00 mg/L標準溶液，圖3為2種空白基質效應值.土壤（吉林黑土）基質中，基質效應值為84%～114%，在0.05 mg/kg呈現(xiàn)弱的基質減弱作用，其他濃度呈現(xiàn)弱的基質增強作用.番茄基質效應值為98%～108%，0.05 mg/kg呈現(xiàn)弱的基質減弱作用，其他濃度呈現(xiàn)弱的基質增強作用.基質效應與濃度之間沒有線性關系，2種基質效應總體較弱.

相對響應值法表明基質效應對HPLC檢測番茄與土壤中吩胺霉素干擾較小，用土壤和番茄基質匹配溶液校正后的回收率與用乙腈溶劑校正的回收率相比偏離較小.

4 結 論

本文建立了高效液相色譜檢測吩胺霉素在土壤和番茄中殘留的方法.實驗發(fā)現(xiàn)，3類土壤對吩胺霉素的吸附性較強，選取提取液（V氨水∶V乙醇∶V二氯甲烷=1∶2∶3），可以達到良好的提取結果；番茄對吩胺霉素吸附性較弱，采用乙腈提取，以堿性氧化鋁為吸附劑，正己烷+二氯甲烷（體積比8∶2）為預淋洗劑，乙酸乙酯為洗脫溶劑，可以達到良好的雜質去除效果.土壤有機質含量、陽離子代換量、黏粒、稱樣量均對回收率產生一定影響.土壤和番茄中平均回收率分別為80.2%～95.7%和80.1%～85.6%，RSD分別為2.14%～4.17%和4.12%～5.17%，在基質中最小檢出量為0.2 ng，最低檢測限`為0.01 mg/kg，本方法基質效應弱，符合農藥殘留分析的要求.

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