血清miRNA-21與腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、NSE對早期非小細胞肺癌的診斷價值

季禹喬，孫明忠*，朱 暉，唐慶國，王文才，王 進，張靈芝，吳芹芹

(東南大學醫學院附屬鹽城醫院 1.檢驗科，2.心胸外科，江蘇 鹽城224001)

血清miRNA-21與腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、NSE對早期非小細胞肺癌的診斷價值

季禹喬1，孫明忠1*，朱 暉1，唐慶國1，王文才2，王 進2，張靈芝1，吳芹芹1

(東南大學醫學院附屬鹽城醫院 1.檢驗科，2.心胸外科，江蘇 鹽城224001)

目的 探討miRNA-21與CEA、CYFRA21-1、NSE對早期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的診斷價值。方法 以50例NSCLC患者作為病例組、60例健康人為對照組，檢測所有研究對象的血清癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)及miRNA-21(miR-21)水平。結果 病例組血清CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21水平均顯著高于對照組(P<0.01)。CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21診斷NSCLC患者的受試者特征工作曲線(ROC曲線)下面積(AUC)分別為0.918、0.826、0.853、0.866，以CEA診斷效能最高。TNMⅠ-Ⅱ期的NSCLC患者血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.05)。Logistic多元回歸分析結果顯示，早期NSCLC(TNMⅠ-Ⅱ期)的發生與血清CYFRA21-1水平、血清miR-21水平均具有相關性(P<0.05)。CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21診斷早期NSCLC的AUC分別為0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21診斷早期NSCLC的效能最高。單獨應用血清CYFRA21-1水平檢測、單獨應用血清miR-21水平檢測和聯合應用兩種血清標志物檢測的AUC分別為0.843、0.872和0.909。結論 NSCLC患者血清miRNA-21與CEA、CYFRA21-1、NSE表達異常，血清miR-21水平對于早期NSCLC的診斷效能較高，可作為輔助診斷的重要血清標志物，將其與血清CYFRA21-1水平進行聯合檢測，可提高其診斷效能。

微小RNA-21；腫瘤標志物；癌胚抗原；細胞角蛋白片段21-1；神經元特異性烯醇化酶；非小細胞肺癌；診斷

(ChinJLabDiagn,2017,21:0576)

在基因表達和進化過程中，高度保守、性質穩定的微小RNA(miRNA)在調節致癌基因表達方面發揮著重要的作用，與細胞增殖、分化以及惡性腫瘤發生、發展、侵襲、轉移等密切相關。研究表明，miRNA參與了肺癌的發生、發展和預后，具有與原癌基因或腫瘤抑制基因相似的作用，在肺癌組織中miRNA有特定的表達譜，參與了調節腫瘤血管生成等多個過程[1，2]。因此，miRNAs可作為生物學標志物用于NSCLC的早期診斷、靶向治療及臨床預后評價。本研究針對血清miRNA-21 (miR-21)及CEA、NSE、CYFRA21-1等血清標志物檢測在早期NSCLC診斷中的價值進行了對比分析，結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2015年1月我院收治的NSCLC患者50例作為病例組，納入患者均經行肺癌腫瘤切除術，術后組織病理學檢查證實為NSCLC，術前均未接受過放、化療治療。其中，男38例、女12例，年齡為45-81歲，平均年齡為(60.8+8.7)歲，鱗癌29例、腺癌21例，TNM分期為：Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例，Ⅳ期9例。同期選取60例體檢合格者為對照組，其中，男47人、女13人，年齡為42-78歲，平均(62.6+8.8)歲。兩組研究對象在年齡、性別構成等方面的差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究納入的所有研究對象均對研究方案知情并簽署知情同意書，研究方案經我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 觀察指標

采集研究對象的空腹外周靜脈血標本(病例組于入院次日，對照組于體檢當日)，血液樣本經常規離心后分離血清，應用全自動電化學發光免疫分析儀(羅氏公司生產)采用雙抗體夾心磁微粒化學發光法對血清標本中的CEA、NSE及CYFRA21-1水平進行檢測和比較，試劑盒為儀器配套試劑盒，嚴格按產品說明步驟進行操作；應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法對血清標本中的miR-21表達水平進行檢測和比較，具體步驟為應用RNA提取試劑盒(美國ABI公司生產)于采集血樣7天內提取總RNA，提取后立即置于-80℃冰箱內保存，采用反轉錄試劑盒(美國ABI公司生產)對miRNA進行反轉錄，反轉錄體系為15 μL，包括100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、MultiScribe Reverse Tran scriptase 1 μl、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μl、RNase Inhibitor 0.19 μl、無菌注射用水4.16 μl、以無菌注射用水1∶1稀釋后的總RNA 5 μl、RT primer 3 μl，引物序列通過查詢Sanger microRNA序列數據庫獲得，為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，反轉錄條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃5 min，4 ℃恒溫，獲得的反轉錄產物立即應用RT-PCR系統(美國ABI公司生產)進行定量檢測，PCR反應體系為20 μl，包括Taq Man Universal Master MixⅡ 10 μl，無菌注射用水4 μl，Taqman MicroRNA Assay 1 μl，以無菌注射用水1∶1稀釋后的反轉錄產物5 μl。PCR檢測反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環。通過PCR自帶軟件生成基線和閾值后，以miR-16為內參，直接讀取各樣本中的miR-21、miR-16的循環閾值(Ct值)，即擴增產物量達到臨界閾值時所對應的循環數，△Ct為miR-21的Ct 值與miR-16的Ct 值的差值，以2-△△Ct表示miR-21的表達水平。

1.3 統計學分析

本研究所有數據均應用SPSS 13.0統計軟件包建立數據庫，計量資料采用(均數±標準差)的形式表示，兩組之間比較應用獨立樣本t檢驗進行處理，以P<0.05為差異有統計學意義，計數資料采用百分率的形式表示。血清標志物診斷效能的比較應用受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)進行比較，取Youden指數最大時的數值作為最佳篩查陽性界值(cut-off)值，并據此對血清標志物單獨檢測和聯合檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、誤診率、漏診率、約登指數進行計算和比較。

2 結果

2.1 兩組研究對象血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的比較

病例組患者的血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平均顯著高于對照組，兩組之間的差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。不同性別、年齡、病理類型的NSCLC患者的血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的差異及不同臨床分期的NSCLC患者的血清CEA、NSE水平的差異均無統計學意義(P>0.05)，TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者的血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者，兩者之間的差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 兩組研究對象血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的比較

表2 NSCLC患者臨床特征與血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的相關性

2.2 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平檢測針對NSCLC的診斷效能比較

四種血清標志物診斷NSCLC的AUC分別為0.918、0.826、0.853、0.866，CEA診斷NSCLC的效能最高，見圖1A、表3。

表3 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1檢測對NSCLC的診斷效能比較

剔除晚期肺癌(TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期)病例數據后，CEA、NSE、CYFRA21-1 、miR-21診斷早期NSCLC(TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期)的AUC分別為0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21診斷早期NSCLC的效能最高，見圖1B、表4；應用Logistic多元回歸分析對四種血清標志物水平與早期NSCLC的相關性進行分析，結果顯示，早期NSCLC的發生與血清CYFRA21-1水平(OR=1.076)和血清miR-21水平(OR=2.473)具有相關性(Waldχ2=4.025、9.153，P<0.05)，見表5；將應用血清CYFRA21-1水平與血清miR-21水平聯合檢測與單獨應用其中之一進行檢測進行比較，結果顯示，單獨應用血清CYFRA21-1水平檢測、單獨應用血清miR-21水平檢測和聯合應用兩種標志物檢測的AUC分別為0.843、0.872和0.909，見圖1C、表6。

A) 診斷NSCLC；B)早期NSCLC(TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期)；C) 血清miR-21、CYFRA21-1水平單獨及聯合檢測診斷早期NSCLC

檢測變量AUC標準誤顯著性95%可信區間下限上限CEA0.9180.0340.0000.8510.985NSE0.8260.0410.0000.7470.906CYFRA21-10.8530.0370.0000.7800.925miRNA-210.8660.0360.0000.7960.936

表4 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平檢測針對早期NSCLC的診斷效能比較

表5 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平與早期NSCLC相關性的多因素分析

表6 血清miR-21、CYFRA21-1水平單獨及聯合檢測對于早期NSCLC的診斷效能比較

3 討論

肺癌是全球發病率和死亡率最高的腫瘤，在肺癌病例中，約80%為非小細胞肺癌(NSCLC)病例。近年來，NSCLC發病率出現了逐年增高的趨勢，無論是在我國還是全世界范圍，NSCLC均已成為致死率最高的腫瘤[3-5]。在吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等新型分子靶向藥物相繼進入臨床應用后，含鉑兩藥聯合方案及靶向治療方案有一定程度上提高了晚期NSCLC的療效[6-8]。盡管如此，晚期NSCLC患者的生存率并未得到顯著的提升，總體預后仍然較差[3-5]，因此，提高早期NSCLC的診斷率仍然是改善NSCLC患者預后的關鍵手段。經支氣管鏡，縱隔鏡或胸腔穿刺進行組織活檢是診斷NSCLC的最可靠方法，但這些有創性檢查在應用時具有較多的禁忌癥，不能作為早期篩查和連續監測的手段。血清學標志物檢測具有操作簡便、價格低廉、無創傷、樣本易獲得、可連續監測等諸多優點，一直是早期NSCLC輔助診斷手段研究領域的熱點。目前，臨床上已經先后探討癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、糖蛋白-199(CA-199)、細胞角蛋白5/6 (CK5/6)、細胞角蛋白HMW(CK-HMW)、甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)和細胞角蛋白8/18(CK8/18)等診斷價值，但尚未尋找到一種可以單獨用于早期NSCLC診斷的可靠指標[9]，聯合檢測已成為提高血清標志物針對早期NSCLC診斷效率的主要手段。

本次研究結果顯示，病例組血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平均顯著高于對照組(P<0.01)，這說明NSCLC患者血清miR-21及常規血清標志物的異常表達。血清CEA、NSE、CYFRA21-1和miR-21診斷NSCLC的AUC分別為0.918、0.826、0.853、0.866，提示CEA是NSCLC發生的最有效指標。CEA是一種廣譜性腫瘤標志物，可在多種腫瘤中表達，而且還與腫瘤惡性化具有密切的相關性，在臨床上主要用于輔助診斷惡性腫瘤、判斷腫瘤分期和病變程度、監測治療和預報復發等方面。研究表明，NSCLC患者血清CEA水平與其EGFR基因突變率具有相關性，血清CEA水平可作為指導NSCLC靶向治療的指標[10]。血清CEA水平也是影響NSCLC患者預后的獨立因素，NSCLC患者CEA水平的升高與其術后生存率的下降相關，血清CEA水平的高低可用于預測手術切除腫瘤后的NSCLC患者的預后，對于難以獲得組織標本的復發晚期NSCLC患者，其水平也可作為預測EGFR-TKI藥物療效的參考指標[11]。盡管如此，本研究未觀察到不同TNM分期患者血清CEA水平差異表達，這說明CEA對早期NSCLC的指示作用并不顯著。

本次研究結果顯示，TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者的血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.05)，Logistic多元回歸分析結果顯示，早期NSCLC(TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期)的發生與血清CYFRA21-1水平和血清miR-21水平具有相關性(P<0.05)。血清CEA、NSE、CYFRA21-1和miR-21診斷早期NSCLC的AUC分別為0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21診斷早期NSCLC的效能最高，單獨應用血清CYFRA21-1水平檢測、單獨應用血清miR-21水平檢測和聯合應用兩種血清標志物檢測的AUC分別為0.843、0.872和0.909，這說明在本研究選取的四種血清標志物中，miR-21、CYFRA21-1的表達水平與患者的TNM分期具有一定的相關性，對于早期NSCLC的診斷具有一定的輔助作用，在單獨檢測時，血清miR-21水平診斷早期NSCLC的效能要高于其它標志物，可作為輔助診斷早期NSCLC的重要血清標志物，而將血清miR-21水平和血清CYFRA21-1水平進行聯合檢測可提高其診斷效能。既往研究證實，肺癌組織中miR-21的表達水平顯著高于正常肺組織，腫瘤組織miR-21高表達的肺癌患者的復發轉移率顯著高于miR-21低表達的患者，且患者生存期也會明顯降低[12]。根據一項針對8篇研究文獻、600例病例，440例對照研究對象的Meta分析結果[13]，血清miR-21診斷早期肺癌的合并敏感度為72%，合并特異度為84%，AUC為0.898。與該研究相比較，本研究結果在敏感度估算方面存在一定的差異，這種差異可能與本研究樣本量少于Meta分析研究有關，也可能與該研究選取的研究對象包含其它類型肺癌病例有關。

CYFRA21-1是一種上皮來源的新型腫瘤標記物，血清CYFRA21-1水平與肺癌患者的影像學疾病控制(DC)和無進展生存期(PFS)等指標具有相關性[14]，可敏感地反映影像學腫瘤體積大小的變化，可作為評價進展期NSCLC患者化療療效的替代指標[15]。本研究中未得出NSE在診斷NSCLC特別是早期NSCLC方面具有優勢的結果。作為腫瘤標志物，NSE主要是與神經母細胞瘤和小細胞肺癌(SCLC)特異性相關，而在NSCLC診斷方面的作用則不及其它一些腫瘤標志物[16]，在臨床上經常將NSE與CEA、CYFRA21-1、CA199、糖蛋白抗原125(CA125)、鱗狀細胞癌相關抗原(SCC)等進行聯合檢測，用于各類肺癌患者的鑒別診斷、化療療效評價和預后評價[16]。

綜上所述，NSCLC患者表現為血清miR-21及血清腫瘤標志物的異常表達，血清miR-21水平對于早期NSCLC的診斷效能較高，可作為輔助診斷的重要血清標志物，將其與血清CYFRA21-1水平進行聯合檢測，可提高其診斷效能。

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Serum miRNA-21 and CEA,CYFRA21-1,NSE in Diagnosis of Early Non-Small Cell Lung Cancer

JIYu-qiao,SUNMing-zhong,ZHUHui,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheAffiliatedYanchengHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege,Yancheng224001,China)

Objective To compare serum miRNA-21 and serum tumor markers detection in diagnosis of early non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Fifty patients with NSCLC were treated as the case group and 60 cases of healthy people were treated as the control group.The serum carcinoma embryonic antigen (CEA) and cytokeratin protein fragment 21-1 (CYFRA21-1),neuron specific enolase (NSE) and miRNA (miR-21) levels were detected and analyzed in all subjects.Results The serum miR-21,CEA,NSE,CYFRA21-1 levels in the case group were significantly higher than those in the control group (P<0.01).The areas under receiver operating characteristic curve (ROC curve) of serum CEA,NSE,CYFRA21-1 and miR-21 were 0.918,0.826,0.853 and 0.866 in diagnosis of NSCLC.The efficiency of CEA in diagnosis of NSCLC was the highest.The serum miR-21 and CYFRA21-1 level of the NSCLC patients with TNM stage of Ⅰ-Ⅱ stage were lower than those of Ⅲ-Ⅳ stage (P<0.05).Logistic multivariate regression analysis showed that the incidence of early NSCLC (TNM stage of Ⅰ-Ⅱ stage) was correlated with the serum CYFRA21-1 level and the serum miR-21 level (P<0.05).AUC of serum CEA,NSE,CYFRA21-1 and miR-21 were 0.752,0.806,0.843,0.882 in diagnosis of early NSCLC.The efficiency of miR-21 was the highest in diagnosis of early NSCLC.The AUC were 0.843,0.872 and 0.909 for detection of serum CYFRA21-1 only,miR-21 only and the combination detection.Conclusion The miRNA-21 and CEA,CYFRA21-1,NSE are abnormal expression in patients with NSCLC.The efficiency of serum miR-21 detection is higher in diagnosis of early NSCLC and can serve as a serum marker.The combination detection of serum miR-21 and CYFRA21-1 can improve efficiency.

miroRNA-21;tumor markers;carcinoma embryonic antigen;cytokeratin protein fragment 21-1;neuron specific enolase;non-small cell lung cancer;diagnosis

江蘇省鹽城市科技發展計劃項目(YK2013073)

1007-4287(2017)04-0576-06

R734.2

A

2016-09-16)

*通訊作者