硫化氫對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肥大細胞及IL-6的影響

李紅巖，尹宗濤，趙科研

(沈陽軍區總醫院 心血管外科，遼寧 沈陽110840)

硫化氫對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肥大細胞及IL-6的影響

李紅巖，尹宗濤，趙科研*

(沈陽軍區總醫院 心血管外科，遼寧 沈陽110840)

目的 探討硫化氫對野百合堿(MCT)誘導的肺動脈高壓(PH)大鼠肥大細胞及IL-6的影響。方法 將24只雄性SD大鼠隨機分為MCT組、H2S組和control組，每組8只。MCT組：野百合堿60 mg/kg一次性腹腔注射；H2S組野百合堿60 mg/kg一次注射，并且每天腹腔注射NaHS(56 μmol/kg) 1 ml；control組分別注射等量生理鹽水。3周后測定大鼠肺動脈平均壓力(mPAP)、右心肥厚指數[RV/(LV+S)]；甲苯胺藍染色測定大鼠肺組織切片中肥大細胞數量及脫顆粒肥大細胞比例；檢測大鼠血漿中IL-6及H2S的含量。 結果 3周后，MCT組大鼠肺動脈平均壓力、右心肥厚指數明顯高于control組(P<0．05)，肥大細胞計數和脫顆粒肥大細胞比例明顯升高，血漿IL-6升高，而H2S降低。而H2S組能明顯抑制肺動脈平均壓力增高及右心肥厚指數的增加，肥大細胞計數較MCT組降低(單位：n/10 mm2，12.14±3.72 比24.67 ±4.46，P<0.05)；脫顆粒肥大細胞比例降低[(29.31±6.71)% 比(52.15±9.65)%，P<0.05]；同時H2S組與MCT組相比，血漿中IL-6降低，H2S升高，P<0.05。結論 硫化氫可能通過抑制肥大細胞聚集、脫顆粒，以及抑制IL-6的釋放抑制肺動脈高壓形成。

硫化氫；野百合堿；肺動脈高壓；肥大細胞；白介素-6

(ChinJLabDiagn,2017,21:0689)

肺動脈高壓(PH)是臨床中常見且嚴重危害生命健康的心血管疾病之一，有研究表明肥大細胞在肺高壓的發生、發展中扮演著重要的角色[1],肥大細胞可以釋放IL-6等炎癥因子，而且IL-6已經被證實在PH動物模型中發揮重要作用[2]。而硫化氫(H2S)是繼一氧化氮及一氧化碳之后發現的第三種內源性氣體信號分子，具有舒張血管、抑制血管平滑肌細胞增殖的作用[3],亦具有一定的抗炎作用[4]。本實驗旨在通過野百合堿腹腔注射建立肺動脈高壓大鼠模型，并預防性給予H2S干預，觀察干預后肺動脈高壓是否受到抑制，及干預后肺組織肥大細胞及血漿中IL-6的變化，為肺動脈高壓提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體重160-220 g，周齡7周，購自沈陽軍區總醫院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按隨機數字表法分為control組、MCT組及H2S組，每組8只。MCT組及H2S組：野百合堿60 mg/kg劑量一次性腹腔注射后飼養3周，control組注射等量的生理鹽水，相同條件下飼養。H2S組大鼠于注射野百合堿的當天予以腹腔注射NaHS(56μmol/kg)，連續給予3周，MCT組和control組每天給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水，同等條件下飼養3周。

1.2.2 血流動力學指標檢測 參照孫波[5]方法測定肺動脈平均壓力(mPAP:mean pulmonary arterial press)。飼養3周后，大鼠稱體重，10%水合氯醛 35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于小動物解剖臺上。消毒頸部皮膚，作頸部正中偏右縱向切口2 cm，分離皮下，顯露并游離右頸外靜脈1 cm，在其下面穿入兩根2/0手術絲線，遠端結扎，近端活結準備，將微導管預充肝素生理鹽水(防止管腔內存在氣泡)后連接三通管再經換能器連接于BL-420S生物機能實驗系統，調零，肝素鹽水潤管。于右頸外靜脈近端作一斜切口，將微導管插入右頸外靜脈中，將近端活結系緊以固定微導管，通過BL-420S生物機能實驗系統測定并記錄肺動脈平均壓力。

1.2.3 右心室肥厚指數的檢測 mPAP測定之后，正中開胸，完整切下大鼠心臟，沿房室溝剪除心房組織，分別剪取右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)，用濾紙吸去血液后稱重，計算RV/(LV+S) [右心室/(室間隔十左心室)]值,以此作為右心室肥大的指標。

1.2.4 組織固定及染色 自胸腔取出肺組織,分離后用10%中性甲醛經氣管緩慢注入大鼠肺內,使肺平滑膨脹；同時經肺動脈用生理鹽水灌洗肺，5分鐘后將右下肺浸泡于10%中性甲醛中固定。1周后在左右肺的矢狀切面各取組織兩塊,常規脫水,石蠟包埋，肥大細胞染色，測定各組大鼠肺組織甲苯胺藍染色切片中肥大細胞數量及肺血管周圍脫顆粒肥大細胞比例。

1.2.5 血漿內皮素IL-6檢測(ELISA法) 大鼠處死前腹主動脈抽血離心保存，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法進行，嚴格按照試劑盒的說明步驟，檢測大鼠血漿中IL-6的含量。

1.2.6 血漿H2S測定 采用去蛋白方法[6]，首先在玻璃試管中加入0.5 ml 10 g/L醋酸鋅，然后加入0.1 ml血漿標本，振蕩混勻，再依次加入20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽和30 mmol/L三氯化鐵各0.5 ml，室溫孵育20 min，再加入10%三氯醋酸1 ml使蛋白沉淀，加2.5 ml蒸餾水補足體積至5 ml，充分混勻，6 000 轉/min離心5分鐘，吸出上清液，用酶標儀在670 nm波長處測吸光度，依據H2S標準曲線計算血漿中H2S的含量。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

3周后，對照組皮毛光澤，呼吸平穩，活動靈活，體重明顯增加，無死亡；MCT組大鼠出現皮毛枯槁、松毛、無光澤，呼吸急促、肝腫大、活動減少、飲食減少等表現，死亡2只，死亡率為25%；而H2S組食欲可，體質量增加，呼吸平穩，活動良好，死亡1例，死亡率12.5%。

2.2 control組、MCT組及H2S組各指標檢測比較

結果見表1。各組大鼠mPAP組間比較有統計學意義，P<0.05，與對照組相比，MCT組mPAP顯著升高，差異顯著(P<0．05)，H2S組大鼠mPAP較MCT組下降，差異顯著(P<0．05)。大鼠右心肥厚指數組間比較有統計學意義(P<0.05)，MCT組右心肥厚指數顯著高于對照組(P<0．05)，H2S組右心肥厚指數較MCT組降低，差異明顯(P<0.05)。肥大細胞計數組間比較有統計學意義，P<0.05，與對照組大鼠相比，MCT組大鼠肺組織中肥大細胞計數均明顯增高，差異顯著(P<0.05)；與MCT組大鼠相比，H2S組大鼠肺內的肥大細胞計數明顯減少，差異明顯(P<0.05)。與對照組大鼠相比，MCT組大鼠肺組織中脫顆粒肥大細胞比例明顯增高，差異顯著(P<0.05)；與MCT組大鼠相比，H2S組大鼠肺內的脫顆粒肥大細胞的比例明顯下降，差異顯著(P<0.05)。大鼠血漿中IL-6平均濃度值組間比較有統計學意義，P<0.05。MCT組血漿中IL-6含量顯著高于對照組(P<0．05)，H2S組大鼠血漿中IL-6含量較MCT組降低，差異顯著(P<0．05)。血漿H2S含量組間比較有統計學意義，P<0.05。與對照組比較，MCT組大鼠血漿H2S含量降低，P<0.05；與MCT組比較，H2S組大鼠血漿H2S含量明顯增高，P<0.05。

表 各組測量結果

注：mPAP:mean pulmonary arterial press,RV/LV+VS:right ventricle/left ventricle + septum。與對照組比較，*P<0.05，與MCT組比較，#P<0.05

3 討論

肺動脈高壓是一種累及肺動脈和右心的嚴重疾病，肺動脈壓力持續上升為其基本特征，其發病原因尚未明確，它可以作為一種疾病獨立存在，然而更多見的是多種心肺疾病進展到一定階段的生理表現。PH發生和發展的病理生理基礎是肺血管收縮、肺血管重構和肺血管原位血栓形成。野百合堿是一種生物堿，具有細胞毒性作用，經肝臟代謝后的產物——吡咯野百合堿可損傷肺動脈血管內皮細胞及肺毛細血管，使肺動脈血管重建、肺血管阻力增加，從而導致肺動脈高壓[7]。實驗結果顯示MCT組大鼠mPAP、右心室肥厚指數與對照組相比差異顯著(P<0.05),我們通過野百合堿(60 mg/kg)單次腹腔注射誘導肺動脈高壓大鼠模型。

H2S是近年來發現的又一新的具有心血管調節功能的氣體信號分子。有研究表明H2S具有擴張血管、降低血壓的作用，能夠促進血管平滑肌細胞的凋亡，并且抑制血管平滑肌細胞的增殖[8]，亦具有一定的抗炎作用。本實驗預防性使用外源性H2S供體NaHS對肺高壓大鼠進行干預，結果顯示，MCT組應用NaHS干預后，血漿H2S的濃度明顯升高，mPAP降低了24.98%，右心室肥厚指數下降了20.4%，表明H2S能夠抑制PH的形成。

Miyata等[9]研究指出，在野百合堿所致的大鼠肺動脈高壓模型的肺組織中可見到大量肥大細胞聚集的現象，肥大細胞的聚集對肺動脈高壓的發生、發展起到了重要作用，而且多數肥大細胞以脫顆粒狀態聚集在血管周邊。Bhola K Dahal[10]等指出之所以肥大細胞在野百合堿所致的肺高壓模型中出現大量聚集和脫顆粒現象，是由于野百合堿有很強的毒性作用，進而引起肺組織嚴重的炎癥反應和肺血管的損傷，導致肺血管壓力以及阻力的增加。本實驗證實了Miyata和Dahal等人的研究，在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型的肺組織切片中可以觀測到大量的肥大細胞，結果顯示，MCT組大鼠肺組織中肥大細胞數量明顯增多，較對照組升高了79.21%(P<0.05)，其中脫顆粒肥大細胞比例較對照組升高了76.55%(P<0.05)。給予外源性硫化氫供體硫氫化鈉對肺高壓大鼠進行干預之后，大鼠血漿中H2S的濃度升高顯著，肺組織中肥大細胞數量和脫顆粒肥大細胞的比例明顯下降，說明了H2S對肥大細胞的聚集和脫顆粒有抑制作用。

肥大細胞被激活后能夠產生IL-6、IL-13等炎癥因子，這些介質在PH的發病機制和肺血管重構中發揮著重要的作用[11,12]。本實驗檢測了大鼠血漿中IL-6的含量，結果顯示，MCT誘導的肺高壓模型中血漿IL-6含量明顯升高，H2S組大鼠炎癥因子IL-6的表達較MCT組明顯減少，說明硫化氫能夠抑制IL-6的釋放。提示H2S可能通過抑制肥大細胞的聚集、脫顆粒以及抑制IL-6的釋放干預調節大鼠肺動脈高壓的發生發展。

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Effects of hydrogen sulfide on mast cell and IL-6 in rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline

LIHong-yan,YINZong-tao,ZHAOKe-yan.

(DepartmentofCardiovascularSurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryDistrict,Shenyang110840,China)

Objective To study the effects of H2S on mast cell and IL-6 in rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline.Methods A total of 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups including MCT group,H2S group and control group(n=8 respectively).The rats of MCT group and H2S group were injected with a single intraperitoneal monocrotaline (60 mg/kg),and NaHS (56 μmol/kg) was injected into the rats in H2S group everyday,while the other groups saline was done instead.After 3 weeks,the mean pulmonary artery pressure(mPAP) and ratio of right ventricle/(left ventricle +septum) [RV/(LV+S)] of the rats in three groups were measured.The number of mast cell and degranulation was measured by toluidine blue stain.The plasma IL-6 level and the plasma H2S level of the rats were detected.Results After 3 weeks,compared with the control group,the MCT group showed increased mPAP and RV/(LV+S) (P<0.05);Both the number of mast cell and the ratio of degranulateted mast cell increased.The plasma IL-6 level also increased while the plasma H2S level was decreased.Compared with MCT group,both mPAP and RVHI were prevented in the H2S group.And also the number of mast cell decreased (n/10 mm2,12.14±3.72 vers 24.67±4.46，P<0.05),the ratio of degranulateted mast cell were decreased (29.31±6.71% vers 52.15±9.65%,P<0.05).In addition,H2S can lower plasma IL-6 level.Conclusion H2S probably can ameliorate PH by inhibiting accumulation and degranulation of mast cell and restraining the release of IL-6.

Hydrogen sulfide;Monocrotaline;Pulmonary hypertension;Mast cell;Interleukin-6

遼寧省自然科學基金(2015020421)；中國博士后科學基金(2013M542471)

1007-4287(2017)04-0689-04

R544.1+6

A

2016-08-06)

*通訊作者